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刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)属顶复亚门专性细胞内寄生原虫,是一种世界范围内分布的机会性致病原虫。全世界刚地弓形虫人群感染率约有25%～30%。弓形虫感染在免疫正常的人群中为隐形感染,但是在免疫抑制或缺陷患者(如器官移植患者、艾滋病患者)中,弓形虫感染可引起较为广泛的临床症状严重者可引起死亡。弓形虫感染同时与优生优育有着密切的关系,孕妇在怀孕期间首次感染弓形虫可以引起严重的后果,虫体可穿过胎盘感染胎儿,影响胎儿发育,可导致畸胎、死胎,存活的新生儿也会因为先天性感染常有畸形及智力发育不全等严重后遗症。此外,弓形虫在动物与动物、动物与人之间广泛传播引起人畜共患弓形虫病,严重影响了我国畜牧业的生产和发展,也成为人类感染弓形虫病的重要传染源。弓形虫病已经成为严重的世界性公共卫生问题。弓形虫病引起的临床症状多样性,给临床诊断治疗及预防带来诸多不便。目前弓形虫病的治疗尚无十分有效的治疗药物,仍以传统药物磺胺嘧啶和乙胺嘧啶联合用药为主,由于它们在治疗过程中不能有效杀灭包囊期虫体以及长期使用产生毒副作用,使其应用受到限制。因此寻找有效的预防与治疗措施,开发安全有效的疫苗成为一大趋势。近年来,研究者利用正反向遗传学,以不同基因型弓形虫虫株蛋白表达差异以及基因多态性为切入点,已经在弓形虫毒力因子的鉴定及其调控上取得一定进展。ROP5是弓形虫的重要毒力因子,在弓形虫强弱毒株(Ⅰ、Ⅲ型)中表达量不同,已证实是导致弓形虫强弱毒株毒力差异的原因之一。前期实验中,我们发现Ⅰ型弓形虫强毒株(RH)与Ⅲ型弓形虫弱毒株(PRU)中rop5基因序列本身不存在差异。但是,RH,PRU型虫株rop5基因上游序列-2000bp存在较多差异。我们推测分析强弱毒株间该rop5基因上游调控序列(rop5-ups)的不同可能是导致ROP5蛋白表达差异的原因。本研究拟利用CRISPR/Cas9系统对弓形虫强弱毒株(RH株、PRU株)rop5基因rop5-ups进行编辑,结合瞬时转染、荧光素酶报告系统、Western-blot等实验手段,分析弓形虫rop5基因rop5-ups的敲除突变对rop5基因表达以及弓形虫在细胞中表型的影响。目的利用CRISPR/Cas9系统对弓形虫强弱毒株(RH株、PRU株)rop5基因rop5-ups进行编辑,结合瞬时转染、荧光素酶报告系统、real-time PCR、Western-blot等手段,分析rop5-ups的敲除突变对rop5基因表达以及弓形虫在细胞中的表型的影响,以阐明ROP5蛋白表达的调控机制。方法1.根据弓形虫数据库ToxoDB,分别设计引物,利用PCR获得弓形虫强弱毒株(RH株、PRU株)rop5基因rop5-ups,测序获得rop5-ups,利用荧光素酶报告系统检测弓形虫强弱毒株(RH株、PRU株)rop5-ups对ROP5蛋白表达的调控功能。2.制备ROP5单克隆抗体。3.利用CRISPR/Cas9系统等建立弓形虫强毒株(RH株)rop5基因rop5-ups的敲除突变株并观察分析基因突变株的表型变化。结果1.通过PCR获得特异的弓形虫强弱毒株(RH株、PRU株)rop5基因rop5-ups,测序结果显示弓形虫强弱毒株(RH株、PRU株)rop5基因rop5-ups存在较大差异。双荧光素酶报告系统结果显示RH及PRU株-2kb上游调控序列中不同位置具有不同的转录调控活性。2.成功制备具有良好免疫反应的ROP5单克隆抗体。3.成功构建靶向突变RH、PRU株rop5-ups及rop5基因的CRISPR/Cas9系统质粒,通过电转染技术获得rop5-upsRH突变虫株及初步观察到该突变虫株在HFF细胞中溢出能力弱于正常RH株。结论弓形虫RH,PRU毒株rop5基因上游序列存在较大差异;两者在rop5上游-2kb上游调控序列中不同位置具有不同的转录调控活性;成功制备具有良好免疫反应的ROP5单克隆抗体;成功构建靶向突变RH、PRU株rop5-ups及rop5基因的CRISPR/Cas9系统质粒,通过电转染技术获得rop5-upsRH突变虫株及初步观察该突变影响虫株在细胞中溢出能力减弱。