研究背景与目的以吉非替尼为代表的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂在改善晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)疗效与生活质量中的作用已经得到国际多中心临床研究的充分肯定。研究证实:吉非替尼对具有EGFR激酶区域特征性突变的NSCLC(外显子19缺失及外显子21 L858R突变)患者疗效显著。但这些患者随着治疗时间的延长,最终均不可避免地产生耐药而导致疾病进展。此外,并非所有负载上述活性突变的NSCLC者均享有同等疗效,部分病人即使初始有效却极易发生耐药。因此,阐明制约吉非替尼发挥药效和产生耐药的影响因素及其机制,探讨与之协同的调节治疗方法,创立新的联合治疗模式,对于更好发挥吉非替尼的药效潜力,进一步提高肺癌的临床治疗水平,具有重要的意义与价值。本研究旨在解析NSCLC对吉非替尼耐药的相关因素及可能的机制,研究细胞因子诱导杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIK细胞)过继输注与吉非替尼联合应用的意义,探讨其作为一种新的临床治疗模式在克服耐药、改善疗效中的可能作用与地位。研究内容与方法第一部分吉非替尼对NSCLC的疗效及其影响因素收集广州医学院第一附属医院肿瘤血液中心接受吉非替尼250mg/天治疗的33例NSCLC患者的外周血标本,及50例手术后复发的NSCLC患者的肿瘤组织标本(6例接受吉非替尼治疗的患者同时收集了外周血和肿瘤组织标本)。酶切富集PCR法分析EGFR基因外显子19、21突变,比较性别、吸烟史对EGFR基因突变检出及吉非替尼治疗反应的影响;免疫组化检测NSCLC患者组织标本中EGFR、p-Erk、p-Akt、p-Stat3和p53的表达,探讨吸烟影响NSCLC患者吉非替尼治疗反应的可能机制。第二部分吉非替尼耐药人肺腺癌PC-9细胞株的建立及其生物学特性选择吉非替尼敏感的人肺腺癌PC-9细胞株(EGFR基因外显子19 E746- A750缺失,p53突变),采纳大剂量吉非替尼冲击结合逐步递增浓度体外诱导获得吉非替尼耐药株PC-9/GR。用CCK-8法检测细胞的耐药指数,测定细胞群体倍增时间和细胞生长曲线,软琼脂克隆形成试验观察细胞的体外克隆形成能力,PI染色法和Annexin-v/7-AAD双标记法观察细胞周期和细胞凋亡,探讨吉非替尼对PC-9细胞和PC-9/GR细胞的治疗反应,PCR直接测序法分析PC-9细胞和PC-9/GR细胞EGFR基因外显子19、20序列,Western blot法检测PC-9细胞和PC-9/GR细胞EGFR信号转导通路分子的表达,免疫细胞化学染色法检测PC-9和PC-9/GR细胞p53蛋白表达。第三部分CIK细胞对吉非替尼耐药肺腺癌(PC-9/GR)细胞的杀伤效应研究应用细胞与裸鼠移植瘤实验,比较观察CIK细胞对PC-9和PC-9/GR细胞的杀伤率以及对移植瘤增殖的抑制效率,研究CIK细胞与吉非替尼联合应用对耐药株PC-9/GR的协同杀伤效应。第四部分CIK细胞输注对肿瘤患者免疫微环境的调节为了进一步理解CIK细胞过继回输可能的免疫调节机制在应对耐药中的地位,对4例恶性肿瘤患者共6个疗程回输CIK细胞治疗后的免疫内环境进行了动态观察。CIK细胞过继回输采纳新建的CO2循环供气密闭波浪式CIK细胞培养系统,流式细胞仪跟踪CIK细胞的诱导分化,CCK-8法检测CIK细胞体外杀伤K-562肿瘤细胞活力,分别于患者接受CIK细胞输注前、输注后1天、1周、2周、1月采集EDTA抗凝外周血,应用流式细胞仪和液相芯片检测分析免疫细胞亚群和细胞因子/趋化因子的动态变化。与此同时,对新建体系与静置培养系统体外扩增培养CIK细胞的效率进行了研究比较,并观察了重组人IL-2撤除及冻存、复苏对CIK细胞杀伤活性的影响,为建立高效、节能、具有质量保障的CIK细胞临床应用标准化规范流程提供可参照模板。结果第一部分吉非替尼对NSCLC的疗效及其影响因素33例接受吉非替尼治疗的患者,总体客观缓解率为42.4%,中位疾病无进展生存期为3.000(1.972～4.028)个月,单因素分析显示血浆EGFR基因突变阳性的患者或不吸烟患者接受吉非替尼治疗的客观有效率和中位疾病无进展生存期高于血浆EGFR基因突变阴性的患者或吸烟患者,P<0.05;多因素回归分析显示血浆游离核酸EGFR基因突变为吉非替尼治疗客观缓解率的唯一独立影响因素(P=0.002),而血浆游离核酸EGFR基因突变(P=0.007)、吸烟史(P=0.040)均为疾病无进展生存期的独立影响因素。分层分析显示:吸烟史主要影响EGFR基因突变患者吉非替尼治疗的中位疾病无进展生存期,P<0.05。在总共77例标本中,检出EGFR基因突变35例(45.5%),其中不吸烟患者肿瘤组织样本中EGFR基因突变明显高于吸烟患者(56.1% vs. 33.3%,P=0.045),但性别对EGFR基因突变率没有明显影响;在50例肺癌组织中,p53突变蛋白检出率为48.0% (24/50),EGFR表达阳性率为48.0% (24/50),p-Akt蛋白阳性率为48.0% (24/50),p-Erk蛋白阳性率为36.0% (18/50),p-Stat3蛋白阳性率为24.0% (12/50)。p53突变蛋白在吸烟患者(61.5%,16/26)和EGFR基因野生型患者(60.7%,17/28)中的表达显著高于不吸烟患者(33.3%,8/24)和EGFR基因突变患者(31.8%,7/22), P<0.05,而p-Akt、p-Erk、p-Stat3蛋白的表达与吸烟史、EGFR基因突变未见明显相关性;进一步分析吸烟对不同EGFR基因突变状态NSCLC患者EGFR、p-Stat3、p-Erk、p-Akt、p53蛋白表达影响时发现,在EGFR基因野生型肺癌中,吸烟与否与p53突变蛋白的表达并无相关性;而在EGFR基因突变型肺癌,吸烟患者p53突变蛋白检出率则明显高于不吸烟者,75.0% vs. 7.1%,P=0.02,其他各组未见统计学明显差异。第二部分吉非替尼耐药人肺腺癌PC-9细胞株的建立及其生物学特性经大剂量吉非替尼冲击结合逐步递增浓度体外诱导,建立了能够在10umol/L吉非替尼浓度下长期培养生长的细胞株,命名为肺腺癌吉非替尼耐药株PC-9/GR。亲本PC-9细胞群体细胞倍增时间是PC-9/GR细胞的1.64倍,经CCK-8法检测,PC-9/GR细胞的吉非替尼半数抑制浓度(IC50)是亲代PC-9细胞的100.16倍,而对顺铂无交叉耐药;吉非替尼作用后可呈剂量依赖性显著抑制PC-9的细胞增殖,诱导细胞G0/G1期周期阻滞和细胞凋亡,但对PC-9/G R细胞的作用较PC-9细胞明显减低。对PC-9/GR和PC-9细胞EGFR基因外显子19和20进行序列分析后发现PC-9/GR细胞除了能检测到与亲本细胞相同的EGFR基因外显子19 E746-A750缺失突变外,还额外检测出EGFR基因外显子20 T790M突变;Western blot发现,PC-9细胞经吉非替尼处理后,之前处于活化状态的p-EGFR,p-Erk及p-Akt呈现剂量依赖性抑制,但同样处理的PC-9/GR细胞较处理前上述分子的活化并无明显变化;p53蛋白免疫细胞化学染色均能观察到定位于细胞核呈棕黄色至棕褐色颗粒的p53蛋白表达。第三部分CIK细胞对吉非替尼耐药肺腺癌(PC-9/GR)细胞的杀伤效应研究CIK细胞对PC-9和PC-9/GR细胞体外杀伤活性无明显差异,CIK细胞输注对PC-9和PC-9/GR细胞移植瘤的生长都有一定的抑制作用,肿瘤生长速度明显减慢,肿瘤组织重量显著减轻,与对照组比较差异有统计学意义,P<0.05,但CIK细胞输注对肿瘤的抑制率在PC-9和PC-9/GR移植瘤之间无统计学差异;CIK细胞和吉非替尼同时作用于PC-9/GR细胞呈现一定的协同杀伤活性作用(CDI<1),且随着吉非替尼浓度的增加或CIK细胞效靶比的提高,二者的协同杀伤活性作用呈现增高的趋势。第四部分CIK细胞输注对肿瘤患者免疫微环境的调节4例患者共进行了6次CIK细胞体外扩增,扩增前外周血单个核细胞总数为1.2×109~1.6×109个,CD3+CD56+细胞的比率为2.1%~4.4%。经抗人CD3单抗、IFN-γ和IL-2刺激,循环供气密闭波浪式培养体系培养21天后,细胞总数达到1.0×1010~1.5×1010个,CD3+CD56+细胞的比率为14.7%~31.0%,CD3+CD56+细胞绝对数达到1.26×109~4.65×109个,CIK细胞回输后无明显的毒/副反应;患者在接受CIK细胞治疗后外周血NK细胞比率逐渐增加、Treg细胞比率下降,在CIK细胞治疗后第2周、1月时与治疗前相比,差异显著,P<0.05;进一步分析NK细胞亚群发现:CIK细胞过继治疗后,CD3-CD16dimCD56bright NK细胞比率较治疗前下降,而CD3-CD16brightCD56dimNK细胞比率则较治疗前升高;血浆IFN-γ、IP-10、RATENS在CIK细胞治疗后1天表达升高后回落,治疗后2周再度明显升高,分别与治疗前相比,差异显著;TNF-α、IL-15、MCP-3在CIK细胞治疗后2周较治疗前表达明显增加,与治疗前相比差异显著,P<0.05;MCP-1治疗后的表达呈现逐渐增加,至治疗后2周达高峰后开始回落,与治疗前相比,差异显著,P<0.05;MIP-1α在CIK细胞治疗后表达下降,至治疗后1周开始回升,治疗后1月时已基本回到治疗前水平,治疗后1天、1周、2周与治疗前相比,差异显著,P<0.05;TGF-β在CIK细胞治疗的初期轻度增加,治疗后2周开始明显下降,至治疗后1月时与治疗前相比,下降约54.85%。进一步比较循环供气密闭波浪式培养体系和培养瓶静置培养体系对CIK细胞体外扩增的影响,发现循环供气密闭波浪式培养体系细胞数目、细胞表型、细胞生物学活性与培养瓶静置培养体系未见明显差异;IL-2撤除及冻存复苏能够降低CIK细胞对K562细胞的杀伤活性,重新给予IL-2刺激,可以恢复CIK细胞对K562细胞的杀伤活性。结论1、EGFR活性突变是NSCLC应用吉非替尼分子靶向治疗发挥疗效的核心影响因素,吸烟易合并p53突变,与诱导耐药密切相关。2、拥有吉非替尼靶标合并p53突变的肺腺癌发生耐药的机制,与选择性获得EGFR基因外显子20 T790M突变细胞克隆有关,此克隆PI3K/Akt、MAPK/Erk1/2通路持续活化,对亲本细胞敏感剂量范围内的吉非替尼无反应。3、CIK细胞对吉非替尼耐药PC-9/GR细胞具有较强的杀伤活性;与吉非替尼具有协同作用,并具有一定程度逆转耐药的效应。4、CIK细胞过继回输能够上调肿瘤患者体内参与抗肿瘤天然免疫应答的、发挥细胞毒效应的NK细胞亚群,下调介导肿瘤免疫耐受的关键细胞因子和调节性T亚群,是一种具有临床应用价值的抗肿瘤个体化免疫调节模式。吉非替尼联合CIK细胞过继性回输可能为我国特色性EGFR基因突变NSCLC的治疗带来新的突破性进展。5、新建成的循环供气密闭波浪式培养制备CIK细胞标准化体系,具有质量稳定保障、高效节能、简便易行等特点,便于临床常规应用的规范化。