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柯萨奇病毒属于肠道病毒属,可引起心肌炎、感冒、流行性胸肌痛、无菌性脑膜炎等。其分为A、B两组,A组由1-22,24型组成;B组由1-6型组成。其中,柯萨奇病毒B组5型可能成为我国手足口病的又一重要病原。柯萨奇病毒B组5型的基因组分为5’端非翻译区(untranslated region,UTR),3’-UTR和P1、P2、P3蛋白编码区。P1区编码衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4,P2和P3区编码非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。天然免疫是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线。宿主通过识别病原相关分子模式,触发信号级联反应诱导I型干扰素基因表达和炎症反应,启动抗病毒天然免疫应答并激活获得性免疫反应,从而清除感染的病毒。同时,有些病毒编码的非结构蛋白可能会与通路中的蛋白因子产生相互作用,阻碍I型干扰基因的表达和炎症反应的发生。目前,由于对CVB5研究较少,病毒感染和复制机制尚不清楚,一般病毒的非结构蛋白在病毒感染、复制过程中起重要的作用。所以,研究CVB5对天然免疫应答的影响,以及CVB5哪个或哪种非结构蛋白对天然免疫应答造成影响,会预防和控制CVB5的发生和传播提供了理论基础。本实验内容包括以下方面:1)柯萨奇病毒B组5型的鉴定、培养和纯化。本实验提取本实验室保存的CVB5的病毒株的RNA,并进行逆转录。以cDNA为模板,进行PCR,测序。序列在NCBIblast 比对,确定实验室保存的病毒株是柯萨奇病毒B组5型。将CVB5在HEK293T上扩大培养,分别以三种方法纯化和浓缩病毒,分别是聚乙二醇6000浓缩异丙醇沉淀、聚乙二醇6000浓缩蔗糖密度梯度离心以及50kD透析袋纯化,并分别对三种不同方法纯化出的病毒检测其感染细胞的情况进行的初步的验证。找到一种相对病毒损失较低的方法,并对纯化后的病毒进行病毒滴度的测定,以及0MOI、0.01MOI、0.1MOI和1MOI的病毒分别在Oh、6h、12h、24h、36h和48h引起细胞病变情况的验证。为后续深入研究CVB5在天然免疫应答中NF-κB通路的影响奠定了基础。2)柯萨奇病毒B组5型对天然免疫应答中NF-kB通路的影响。本实验预首先通过荧光素酶报告基因检测CVB5对天然免疫通路中NF-κB启动子水平的影响。通过接种不同MOI的CVB5以及接种CVB5不同时间检测NF-κB的启动子水平发现,0.01MOI的CVB5在接种12h时和对照相比能够明显降低NF-κB的启动子水平。通过接种CVB5检测p65和TNF-α的mRNA水平发现,0.01MOI的CVB5在接种12h时能够明显降低p65和TNF-α的mRNA水平,且随着接种时间的增加p65和TNF-α的mRNA水平又有所增加。通过接种CVB5检测p65的蛋白水平发现,0.01MOI的CVB5在接种12h时能够明显降低p65的蛋白水平。综合对NF-κB的启动子水平、p65和TNF-α的mRNA水平和p65蛋白的蛋白水平的实验结果可以确定,柯萨奇病毒B组5型是能够降低天然免疫应答中NF-κB通路的炎症反应。3)柯萨奇病毒B组5型的六种非结构蛋白2A、2B、2C、3AB、3C和3D对天然免疫应答中NF-κB通路的影响。将本实验室保存的柯萨奇病毒B组5型的六种非结构蛋白的真核表达载体pcDNA3.1(+)-2A-2Flag、pcDNA3.1(+)-2B-2Flag、pcDNA3.1(+)-2C-2Flag、pcDNA3.1(+)-3AB-2Flag、pcDNA3.1(+)-3C-2Flag 和 pcDNA3.1(+)-3D-2Flag分别转染至HEK293T细胞中,检测其对p65和TNF-α的mRNA水平以及p65蛋白水平的影响。结果发现3D蛋白能够明显降低p65的mRNA水平,3AB蛋白能够明显的降低TNF-α的mRNA水平,六种非结构蛋白能增加p65的蛋白水平。通过本研究可以确定柯萨奇病毒B组5型能够降低天然免疫应答中NF-κB通路的影响,为进一步研究病毒感染过程中的作用机制奠定基础。