研究背景及目标:在血管中膜钙化过程中,多种因素介导的血管平滑肌细胞向成骨细胞样表型转化是基本的病理特征。课题组既往研究发现Nrf3（Nuclear Factor,Erythroid 2 Like3）参与胚胎干细胞向血管平滑肌分化,表明Nrf3在心血管疾病中可以起到一定的作用。然而,在血管钙化进程中,Nrf3能否影响血管平滑肌成骨表型转化,从而调节血管钙化的进程还未有研究。本研究试图阐述Nrf3对血管钙化的作用,并寻找Nrf3参与血管钙化的可能通路,阐述其作用机制,为血管钙化的防治提供新的思路。研究方法:首先,我们在体外分离培养小鼠原代主动脉平滑肌细胞,在2.7 m M的氯化钙和2 m M的磷酸二氢钠的培养条件下诱导平滑肌细胞钙化,模拟临床上CKD（Chronic kidney disease）病人循环血中高钙高磷的环境,然后检测平滑肌细胞的Nrf3在钙化过程中的变化。与此同时我们还在平滑肌细胞钙化过程中过表达或抑制Nrf3,研究Nrf3在平滑肌细胞成骨样表型转化中的作用。其次,利用小鼠主动脉转录组测序、平滑肌细胞染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,Ch IP）测序及生物信息学分析、分子克隆等一系列方法鉴定Nrf3的功能性靶基因。第三,我们通过过表达或敲低靶基因探究其作用的部分机制。在动物实验上,我们采用高剂量维生素D（Vitmin D,VD）诱导小鼠血管钙化,比较野生型小鼠、Nrf3全身敲除小鼠和Nrf3血管平滑肌特异敲除小鼠血管钙化严重程度,在体探讨Nrf3在VD诱导的血管钙化模型中对其的作用。最后,分别采集CKD病人的钙化血管和非钙化的血管,探索Nrf3的表达差异情况。结果:原代血管平滑肌细胞用钙化培养基诱导细胞钙化,分别在0、1、3、5天提取RNA,发现Nrf3在平滑肌细胞钙化过程中表达显著升高。在细胞功能学研究中,敲除或者敲低Nrf3后,VSMC钙化减轻;反之,钙化明显加重。随后我们利用CHIP在体外寻找Nrf3下游靶点。根据CHIP-seq结果和相关文献,选定miR-101c可能为Nrf3的功能性靶基因,再结合双荧光素酶报告基因（Dual-luciferase reporter gene）实验发现Nrf3可以直接结合调控miR-101c的downstream区域。VSMC过表达Nrf3后,miR-101c在RNA水平表达下调,而抑制Nrf3则使其表达升高。双荧光素酶报告实验和分子克隆实验证实,过表达Nrf3能明显降低miR-101c 3’UTR调控的荧光素酶活性。在体外VSMC钙化过程中,miR-101c表达逐渐降低,抑制miR-101c表达可明显加重VSMC的钙化,反之则减轻。通过查找数据库,我们首先预测了Map3k1,Akt2,Msx2作为miR-101c的潜在下游分子靶点,通过一系列分子实验及双荧光素酶报告实验,我们发现miR-101c不能调控Akt2和Msx2,而Map3k1则是miR-101c的下游靶点之一。miR-101c可以通过调节Map3k1/ERK的磷酸化来影响血管的钙化。在体实验中,我们将Nrf3-KO小鼠和对照小鼠主动脉送mRNA转录组测序,发现两组在ERK的信号通路中同样存在差异。然后用维生素D诱导小鼠血管钙化,Nrf3全身敲除和平滑肌特异敲除小鼠主动脉的miR-101c表达升高,血管钙化程度减轻。对主动脉进行免疫荧光染色发现,Nrf3敲除的小鼠,p-ERK和RUNX2的荧光强度显著低于对照组。结论:本研究成功地揭示了Nrf3在血管钙化中的作用,Nrf3可以促进VSMC成骨样表型转化从而促进血管钙化。MiR-101c是Nrf3的功能性靶基因,Nrf3可直接结合miR-101c的downstream区域,抑制其表达。MiR-101c通过抑制Map3k1/ERK的磷酸化,降低Runx2的表达,减轻血管的钙化。提示Nrf3/miR-101c可能是治疗血管钙化相关疾病的新靶点。