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研究背景:CART疗法在血液系统恶性疾病尤其是B-ALL中取得了突破性进展,是恶性肿瘤细胞免疫疗法的成功典范。然而复发仍是目前CART治疗后的最大障碍。单纯依靠输注CART的患者超过半数在一年内复发,严重影响CART的长期疗效。寻找复发因素和机制,研究有效干预手段是亟待解决的问题。CART以抗原抗体结合取代TCR-MHC抗原复合物识别,导致其免疫突触结构不稳定,进而影响T细胞活化信号强度和持续时间,因此在T细胞活化信号转导和杀伤作用方面与传统CTLs均有不同之处。研究CART杀伤过程中的动态变化,杀伤机制及其特点,是理解治疗后复发的基础。现有的研究认为除了肿瘤克隆本身生物学行为改变从而逃逸CART杀伤,CART自身结构缺陷造成的体内无法长期维持等方面因素外,体内抑制性免疫微环境尤其是骨髓微环境亦是导致复发的重要因素且相对研究结果较少。探索CART治疗中潜在的抑制性因素,是进一步研究CART治疗后复发机制和提高CART疗效的可能方向。骨髓间充质干细胞（MSCs）是体内重要的骨髓免疫抑制性因素,通过直接接触或分泌细胞因子等方式调节多种免疫细胞功能。MSCs对活化T细胞具有强大的抑制作用,在临床上已成熟地应用于移植物抗宿主病和自身免疫性疾病。MSCs可通过分泌IDO、galectins、COX-2等因子诱导T细胞凋亡,抑制T细胞增殖。我们推测MSCs对CART细胞也应有类似的抑制作用,并可能作为干预CART治疗后复发的靶点。第一章Galectin-9调控骨髓来源间充质干细胞抑制CART增殖及杀伤效应研究目的:复发仍是目前存在的影响CART长期疗效的最主要问题。骨髓微环境中的抑制性组分是导致CART治疗后复发的重要原因。以往的研究显示骨髓间充质干细胞对T细胞具有抑制增殖、促进凋亡等抑制作用,但在CART治疗中尚无文献报道。本章主要研究体内外骨髓间充质干细胞对CART细胞的抑制作用。研究方法:分离健康供者骨髓单个核细胞,贴壁培养纯化以获得人骨髓来源的MSCs（h BM-MSCs）,取p3-p5代细胞作为研究材料。将h B-MSCs与CART细胞按h BM-MSCs:CART=1:20、1:10、1:5的比例进行共培养:取1×105数量h BM-MSCs分别于常规孔板和transwell孔板贴壁6小时,后加入相应数量经Befeldin（10u M）预处理24小时或未经处理的CART细胞于常规孔板,加入相应数量未经处理的CART细胞于transwell孔板,共培养3天后收集三组中悬浮的CART细胞,台盼蓝染色计数,流式检测胞内Ki67及表面抑制性分子PD-1、TIM-3和LAG-3的表达。体外h BM-MSCs干预CART杀伤靶细胞luciferase-nalm6分为3组:1、将h B-MSCs与CART细胞按h BM-MSCs:CART=1:20、1:10、1:5的比例共培养3天后收集CART细胞,再与luciferase-nalm6共培养;2、将h B-MSCs按h BM-MSCs:CART=1:20,1:10,1:5的比例先种板贴壁,后加入相应数量的CART与靶细胞;3、将h B-MSCs与luciferase-nalm6细胞按h BM-MSCs:luciferase-nalm6=1:20、1:10、1:5的比例共培养3天后收集luciferase-nalm6细胞,再与CART细胞共培养。以上三组的杀伤条件为效靶比1:1杀伤6小时或0.5:1杀伤12小时。酶标仪法检测各组杀伤率。用含有针对gal-9蛋白sh RNA的慢病毒感染MSCs获得稳定敲降的原代细胞,未感染及稳定转染空载慢病毒的MSCs细胞作为对照,分别与CART细胞按1:5比例共培养,流式检测三组中CART增殖及表面抑制性分子TIM-3的表达。收集三组中CART细胞,按效靶比1:1杀伤6小时或0.5:1杀伤12小时的条件与靶细胞luciferase-nalm6共培养;将稳定敲降gal-9的MSCs及对照h B-MSCs按h BM-MSCs:CART=1:5的比例先种板贴壁,按效靶比0.5:1杀伤12小时的条件加入相应数量的CART与靶细胞共培养,检测预处理及直接接触情况下gal-9的表达对于MSCs抑制CART杀伤作用的影响。MSCs干预CART治疗B-ALL小鼠模型试验中,第-7天各组尾静脉输注1×10~6个luciferase-nalm6,第-2天活体成像分组,第-1天尾静脉输注5×10~5个gal-9稳定敲降或未经转染的MSCs并用PBS作为空白对照,第0天尾静脉回输1×10~6个CART19细胞。每隔1周对各组小鼠活体成像,记录生存曲线。研究结果:体外MSCs与CART19以直接接触或transwell隔离的方式共培养3天,CART19活细胞计数显著下降,Ki67表达显著降低,且两种共培养组间无差异。用BFA预处理CART19后再与MSCs行直接接触共培养,则CART19活细胞计数与对照组无显著差异,Ki67仍高表达。共培养不引起CART凋亡或针对MSCs的细胞毒作用,对CART各细胞亚群组成比例无显著影响。共培养特异性上调CART表面抑制性分子TIM3高表达,对PD-1或LAG3无影响。经MSCs共培养预处理后CART19对靶细胞luciferase-nalm6的杀伤效率降低,而MSCs预先种板对杀伤影响不大,经MSCs共培养预处理后的luciferase-nalm6仍可有效被CART杀伤。与CART共培养后MSCs高表达gal-9,包装含有特异性sh RNA的慢病毒感染MSCs以稳定敲降gal-9表达,稳定转染的MSCs具有正常的形态与增殖能力。敲降gal-9可部分回复MSCs对CART细胞的增殖抑制及杀伤抑制,且可显著下调共培养后对CART细胞TIM-3的诱导表达。体内野生型MSCs回输干预CART治疗B-ALL可延迟肿瘤清除时间,降低小鼠生存时间。回输敲降gal-9的MSCs可部分回复对CART体内疗效的抑制。结论:人骨髓间充质干细胞主要通过非接触依赖的方式抑制体外CART细胞增殖并特异性上调CART表面TIM-3表达。与h BM-MSCs共培养预处理后的CART19杀伤靶细胞功能显著下降。Gal-9蛋白的诱导表达调控MSCs对CART的杀伤抑制作用。Gal-9蛋白调控MSCs抑制CART体内疗效。第二章穿孔素/颗粒酶途径是CART杀伤靶细胞的主要机制研究目的:CD8+细胞毒T细胞对靶细胞的杀伤机制包括穿孔素/颗粒酶途径,Fas/Fas L途径以及分泌细胞因子直接杀伤靶细胞的非细胞毒形式。CD4+T细胞则主要通过分泌细胞因子协助CD8+T细胞的杀伤作用。CART细胞因其特殊的结构,在杀伤过程中的免疫突触形成、信号转导和细胞毒作用等方面与传统CTLs均有所不同,表现为不稳定的免疫突触形成,活化信号更强持续时间更短,快速释放细胞毒颗粒等。本章旨在研究传统的三条杀伤途径是否参与CART对靶细胞的杀伤,以及CART不同细胞亚群间杀伤能力的特点及其机制。研究方法:在体外杀伤模型中分别加入50n M、100n M、200n M的刀豆素A阻断穿孔素分泌,加入5u M、10u M、20u M的EGTA阻断钙离子依赖的攻膜复合物形成,加入2.5u M、5u M、10u M正befeldin A阻断CART细胞因子释放,加入10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml Fas抗体以封闭靶细胞Fas表达,CSFE标记靶细胞nalm6、过表达CD19的K562和Raji,按效靶比1:1杀伤时间为6小时,流式检测靶细胞CSFE+Annex V+双阳性表达率验证相应途径是否参与CART对靶细胞的杀伤。流式分选CART细胞CD4+亚群与CD8+亚群,与未分选的CD3+混合CART分别与靶细胞luciferase-nalm6或luciferase-Raji按效靶比1:1、2:1、5:1、10:1在96孔板中杀伤4小时、8小时、12小时、24小时,裂解靶细胞后酶标仪检测底物荧光读值以比较不同细胞亚群之间杀伤能力的差异。流式分选CART细胞CD4+亚群与CD8+亚群,分别与靶细胞nalm6按效靶比1:1共培养,流式检测在24小时、48小时、72小时CD4+CART与CD8+CART的细胞凋亡、分化、表面活化及抑制性分子的表达水平。以效靶比1:1为起始,之后再次加入靶细胞观察CD4+亚群与CD8+亚群连续杀伤靶细胞的能力。研究结果:CMA（200n M）或EGTA（20u M）可几乎完全阻断CART对nalm6或CD19+K562的杀伤,各浓度下BFA的处理对其杀伤无显著影响。对于Fas阳性的Raji细胞株,各浓度Fas抗体处理均不能阻断CART对其杀伤;杀伤时间较短或效靶比较低时,相等数量的混合CART杀伤率不及CD8+CART。而在长时间或高效靶比条件下CD8+CART杀伤效率与CD3+混合CART无显著差异。较短杀伤时间条件下CD4+CART杀伤效率均显著低于CD8+CART。当效靶比达到5:1杀伤12小时或效靶比达到2:1杀伤24小时条件下,CD4+CART杀伤效率与CD8+CART无差异且均可全部杀伤靶细胞。CMA（200n M）或EGTA（20u M）可几乎完全阻断CD4+CART对nalm6的杀伤,阻断细胞因子途径与Fas-Fas L途径不能抑制其杀伤。CD4+CART接触靶细胞后CD107a与granzyme B的表达逐渐升高,较传统CD4+T细胞具有显著升高的细胞毒比例。CD8+CART在杀伤过程中迅速脱颗粒且完全表达CD107a与granzyme B;正常培养条件下CART细胞中CD8+亚群具有增殖优势,而在杀伤靶细胞后CD8+亚群更易凋亡,CD4+亚群不易凋亡。CD4+CART较CD8+CART在杀伤靶细胞后更不易往下游分化,表面活化或抑制性分子表达水平更低。CD4+CART较CD8+CART体外连续杀伤靶细胞能力更强。结论:CART细胞主要通过穿孔素/颗粒酶途径杀伤靶细胞。CD4+CART细胞具有较高细胞毒比例,细胞因子途径不参与其杀伤作用。CD4+CART较CD8+CART长期杀伤效率无显著差异,且在杀伤后能保持更好的细胞状态并具有更低的分化水平与TIM-3表达水平。CD4+CART较CD8+CART具有更优越的体外连续杀伤靶细胞的能力。