骨折愈合是指骨折、截骨、关节融合和骨移植术后的自然骨连接过程。骨折愈合的影响因素众多,其中骨折区的力学环境是一个重要的方面,骨折经适合固定后再诱发骨折端细微运动,能刺激骨痂生长,加速骨折愈合过程。然而,关于力学环境影响骨愈合过程的细胞生物学和分子生物学机制目前仍不甚清楚。本课题组早前在临床治疗中发现:完全固定不能加速骨折的痊愈,适当给予病人一定的活动量却可以加速骨折愈合,并加速病人恢复肢体的功能。因此,探讨骨折断端的力学环境对骨折愈合过程的影响不仅可理解骨折愈合机制,而且对临床骨折的治疗、康复具有重要的指导意义。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于中胚层的具有多向分化潜能的成体干细胞,能够向成骨、成软骨细胞等方向分化,骨折损伤部位对MSCs的募集在骨修复中发挥重要的作用,骨折端募集足够数量的MSCs是骨折愈合的前提条件和重要的细胞学基础。研究力学环境对骨折端的干细胞募集和分化的影响对于从细胞水平和分子水平认识骨折愈合机制可提供新证据,进而对临床骨折的治疗和康复过程的设计和力度控制具有实践指导意义。骨折愈合早期是力学刺激促进骨折愈合最为有效的时期,本实验通过手术制备大鼠骨折动物模型,以不同刚度系数外固定架固定为骨折区提供不同力学环境的方法,利用流式细胞术、RT-qPCR、Western-blot等技术手段,观察不同力学环境对骨断端MSCs募集和分化的影响。研究目的:1.通过建立不同刚度系数外固定架固定大鼠股骨骨折的实验模型,以给予骨折股骨不同的力学环境,观察骨折愈合早期不同力学环境对骨断端MSCs的募集是否产生不同影响,从细胞水平解释不同力学环境对骨折愈合的影响。2.从分子水平揭示骨折局部不同力学环境在骨折愈合早期对骨断端MSCs向成骨细胞谱系和软骨细胞谱系分化的不同影响。3.为骨折愈合机制研究提供新的实验数据,对临床骨折的治疗及康复中的力学控制设计提供理论依据。研究方法:1.建立大鼠股骨骨折模型,以不同刚度系数的外固定架予以固定,设置对照组(刚度系数60.6 N/mm)、高刚度组(刚度系数18.2 N/mm)和低刚度组(刚度系数8.5 N/mm)。2.于术后当天、2周后拍摄X-光片,观察骨折愈合情况;术后6周,对骨痂组织进行组织学研究。3.于术后2天、4天、6天、10天,将骨折断端组织取出,分离并计数有核细胞。用流式细胞术检测分离所得细胞中MSCs所占的比例。计算得到三组不同天数骨断端CD29+CD90+(MSCs)的绝对数目。4.于术后2天、6天、10天、14天分别取骨痂组织,通过RT-qPCR检测其中成骨相关基因Runx2、Osterix(OSX)及成软骨相关基因Sox9的表达水平。并通过Western-blot检测Runx2、Sox9蛋白的表达。观察骨断端力学环境对干细胞分化影响。研究结果:1.影像学研究显示,术后2周时高刚度组骨痂量明显少于低刚度组。组织学研究显示,高刚度组大鼠股骨骨折模型均达到了骨性链接,但骨痂较少。低刚度组大鼠股骨骨折模型出现了软骨链接,但软骨部分非常薄,最终没有发生骨化。2.随愈合时间增加,分离得到有核细胞数目呈减少趋势,流式细胞仪检测结果显示CD29+CD90+(MSCs)细胞比例不断减少,最终计算得到MSCs的绝对数目2天>4天>6天>10天(P<0.05);术后同天组间比较,低刚度组多于高刚度组,高刚度组多于对照组(P<0.05)。3.Runx2、OSX的表达水平在14天之内不断升高。Sox9的表达,对照组和高刚度组在术后10天最高,14天有所下降,低刚度组在术后14天之内一直升高。14天之内Runx2、OSX及Sox9的表达水平组间基本低刚度组>高刚度组>对照组。结论:1.在骨折愈合早期,骨折区力学环境会影响募集的MSCs的数目。固定强度低时,骨折端微动多,募集的MSCs增多。2.在骨折愈合早期,骨折区力学环境会影响MSCs向成骨、成软骨细胞谱系的分化。固定强度低时,骨折端微动多,骨痂组织中成骨、成软骨相关基因表达增多。3.微动虽能促进MSCs向成骨和成软骨细胞系分化,但若超过一定幅度则可能无法获得刚性的愈合。在临床治疗过程中应把握骨折端微动的量、控制好力学刺激以促进临床骨折治疗与康复过程,使之既加速骨折愈合进程,又能到达最终的骨性愈合。