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胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)/胰岛素样多肽(insulin-like peptide,ILP)信号系统在脊椎动物的代谢和生长过程中起着至关重要的调控作用。近年来的研究表明,无脊椎动物中也分布着大量的ILP基因,这些基因及其编码的蛋白参与调控包括代谢、生长、生殖和蜕皮等在内的一系列生物学过程。迄今,有关甲壳动物IGF/ILP信号系统的组成、生物学功能及其信号传导途径的研究很少。拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国东南沿海重要的海水养殖蟹类之一,具有很高的经济价值。本文以拟穴青蟹为研究对象,采用分子生物学、细胞生物学以及生物化学等技术手段,首次克隆得到拟穴青蟹IGF/ILP信号通路中的一系列关键基因,包含信号系统成员胰岛素样促雄性腺激素(insulin-like androgenic gland factor,IAG)、单 IGF 结合结构域蛋白(single IGF binding domain protein,SIBD)、IGF 结合蛋白相关蛋白 1(IGF binding protein-related protein 1,IGFBP-rP1)和四个neuroparsin神经肽(NP1～4),以及信号传导重要因子PI3K,Akt,Rheb和TOR。对这些基因及其编码的蛋白进行了基本特征分析,研究了它们的时空表达情况及可能的生理调控机制。主要的研究成果总结如下:1)通过简并引物PCR以及RACE克隆策略,从拟穴青蟹促雄性腺(androgenic gland,AG)中克隆得到 IAG(Sp-IAG)基因的 cDNA 全长序列 1269 bp,其基因组DNA(genomic DNA,gDNA)序列由四个外显子和三个内含子组成。核酸原位杂交结果表明,Sp-IAG基因转录本在促雄性腺Ⅰ型和Ⅱ型细胞中均有分布。RT-PCR分析表明Sp-IAG不仅存在于雄性AG组织,在雄性和雌性个体的大多数组织中都有分布,包括卵巢。采用荧光定量qPCR研究了卵巢中Sp-IAG在拟穴青蟹不同卵巢发育期中的表达变化,结果显示Sp-IAG在未发育期和卵黄发生的前期、早期以及后期表达量低,成熟期表达量显著升高。随后检测了 Sp-IAG在一期仔蟹蜕皮周期中的表达变化,结果表明Sp-IAG表达量从Oh 一期仔蟹(蜕皮后期)到96h 一期仔蟹(蜕皮前期)持续下降,然后在Oh二期仔蟹中显著升高。以上实验结果表明Sp-IAG参与了拟穴青蟹的卵巢发育以及个体生长的进程。IAG是长久以来甲壳动物中发现的唯一的ILP分子,被广泛认为仅由雄性特异的促雄性腺组织合成并分泌,控制着甲壳动物性别分化和雄性第二性征的发育。本研究结果表明IAG在不同物种的功能定位有着明显的差异,并不局限于传统意义上控制性别分化的角色。2)从拟穴青蟹脑神经节的转录组文库中筛选得到SIBD(Sp-SIBD)基因部分片段,经序列验证、RACE克隆等策略得到了 Sp-SIBD基因cDNA全长序列1284 bp。Sp-SIBD在肝胰腺和神经组织表达量较高,原位杂交实验进一步揭示Sp-SIBD基因在肝胰腺组织中定位于分泌细胞,可能作为内分泌调控因子释放入血淋巴。检测了幼蟹在多种分解代谢状态下(包括高温、高渗、挑动和禁食)血糖的变化以及肝胰腺组织中Sp-SIBD基因表达。结果显示,分解代谢过程中无论血糖含量偏高或者偏低,Sp-SIBD基因的表达量均表现出上调。类比脊椎动物IGF结合蛋白1(IGF binding protein 1,IGFBP1)的分泌与作用方式,推测Sp-SIBD可能也作为调控IGF/ILP活性的一种内分泌因子,在分解代谢等不利条件下,Sp-SIBD结合内源的IGF/ILP从而阻止其下游信号传导,抑制个体能量消耗型的生长,直到恢复有利条件。SIBD是近几年无脊椎动物中鉴定到的一类蛋白,是IGFBP超家族N末端IGF结合结构域(IGF binding domain,IB)的同源物,拥有IGF/ILP结合活性。分析无脊椎动物SIBD和IGFBP超家族成员的序列结构以及它们对IGF/ILP的结合活性后,推测SIBD可能是ILP特异性的结合蛋白,无脊椎动物中由SIBD和ILP组成的信号系统可能在地位上相当于脊椎动物中IGFBP和IGF组成的信号系统。3)以拟穴青蟹脑神经节的转录组文库为切入点,首次在同一物种(拟穴青蟹)获得所有已知的三种类型的IB结构域相关蛋白,包括Sp-SIBD,IGFBP-rP1(Sp-IGFBP-rP1)以及NP1～4(Sp-NP1～4)。拟穴青蟹六个IB结构域相关蛋白基因在卵巢和肝胰腺组织较为集中分布,在卵黄发生过程的表达谱分析表明这些基因和卵巢发育过程紧密联系。采用卵巢和肝胰腺组织离体培养的方法研究了这些基因在IGF-1和胰岛素作用下的表达模式。研究结果表明拟穴青蟹中所有六个IB结构域相关蛋白基因都在一定程度上受到IGF-1和胰岛素的调控。NP,SIBD和IGFBP-rP在内的IB结构域相关蛋白可能做为无脊椎动物中ILP的结合蛋白存在,对应于脊椎动物中的IGFBP超家族蛋白。4)利用荧光定量qPCR分析了拟穴青蟹卵黄蛋白原(vitellogenin,vtg)(Sp-vtg)基因在肝胰腺和卵巢组织的表达情况,结果表明肝胰腺是Sp-vtg合成的主要场所,卵巢作为次要的Sp-vtg合成场所,产生的Sp-vtg不到肝胰腺中的1%。后续采用肝胰腺组织离体培养的方法,调查了外源牛胰岛素对Sp-vtg表达的影响。发现胰岛素浓度在200,400和800 ng/mL时,可以刺激Sp-vtg在肝胰腺组织块的显著表达。通过分析拟穴青蟹脑神经节转录组文库,筛选并克隆得到 IGF/ILP 信号传导重要因子 PI3K(Sp-PI3K),Akt(Sp-Akt),Rheb(Sp-Rheb)和TOR(Sp-TOR)。通过RNAi实验敲低Sp-Akt的表达可以阻断胰岛素对Sp-vtg的刺激。通过抑制剂实验发现,抑制Sp-PI3K或Sp-TOR的功能也可以显著抑制胰岛素对Sp-vtg的刺激作用。本研究明确地揭示了胰岛素对离体培养的肝胰腺中Sp-vtg的刺激作用,而PI3K/Akt/TOR信号转导途径是这个过程中的一个重要环节。本研究结果表明拟穴青蟹很可能存在内源性的ILP,并通过传统的IGF/ILP信号通路调控卵巢发育。随着近年来转录组测序技术的发展和应用,在十足目甲壳动物中已有IAG之外的ILP被发现。本研究为进一步明确甲壳动物ILP的功能提供了方向。