背景和目的:硬化性苔藓（lichen sclerosus,LS）是一种免疫介导的慢性炎症性皮肤黏膜病变,好发于生殖器皮肤,生殖器外受累少见。本病发病机制不明,可影响患者生活质量,具有恶变风险,临床表现不典型时易误诊。单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing,scRNA-seq）技术可为每个细胞创建一个单独的转录组文库并将其聚类到不同的细胞群中,获得其在疾病中的全转录组表达谱,进而揭示疾病发生发展过程中的分子调节机制。目前LS中基于单细胞的分子改变在很大程度上是未知的,本课题将着重于通过单细胞转录组测序技术对女阴硬化性苔藓（vulva lichen sclerosus,VLS）皮损组织中可获得的细胞进行分类,构建VLS和正常外阴皮肤组织的细胞群图谱,并基于细胞类型对基因表达量进行分析,评估VLS组织中上调基因的转录组表达的差异及生物学功能,尝试为VLS的治疗提供新思路。此外,本研究也将分析进展期生殖器和生殖器外LS的临床和病理学特征及其差异,以期提高临床医师对本病的认识并减少误诊。方法:1.回顾性分析北京医院皮肤科活检确诊的55例进展期生殖器和生殖器外LS患者的临床病理资料并比较两者差异。2.收集2例VLS患者皮损和2例女性外阴正常皮肤标本,制备细胞悬液,进行scRNA-seq;使用Seurat软件对所有样本的细胞进行无监督聚类,用其FindClusters函数找到每个细胞群的显著差异基因,从中筛选出各群的标记基因,进而定义每种细胞类型;用Seurat软件对VLS组和对照组之间的每个细胞类型占各样本所有细胞类型的比例进行两独立样本的Wilcoxon秩和检验;按照细胞所属样本和分群进行分组后,用FindMarkers函数分析主要参与VLS病理机制的细胞群的同一集群内VLS组较对照组上调表达的差异基因;结合指标pct.1、pct.2和avglog2 FC,与VLS的临床病理与分子生物学特点,筛选最可能与VLS病理机制相关的基因,对差异表达基因进行疾病（Disease Ontology,DO）富集分析、基因本体联合会（Gene Onotology Consortium,GO）注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路分析,探索其相关功能。结果:1.无症状的生殖器外LS患者比例明显高于生殖器LS,生殖器LS出现瘙痒的比例明显高于生殖器外LS,疼痛感仅见于生殖器LS中;生殖器LS标本出现棘层肥厚、血管扩张、嗜酸性粒细胞浸润的比例高于生殖器外LS,出现毛囊角栓的比例低于生殖器外LS。2.4个样本共检测到41090个细胞,其中VLS组18467个,对照组22623个。根据标记基因注释主要区分出11种细胞群,包括角质形成细胞（19325个,44.6%）、内皮细胞（6747个,15.6%）、成纤维细胞（5718个,13.2%）、T细胞（3497 个,8.1%）、平滑肌细胞（2228 个,5.1%）、黑素细胞（1138 个,2.6%）、树突状细胞（807个,1.9%）、肥大细胞（631个,1.5%）、巨噬细胞（570个,1.3%）、神经细胞（237 个,0.5%）、浆细胞（192 个,0.4%）。3.VLS皮损的角质形成细胞群中,上调基因共32个,其中最可能与VLS发病机制相关的基因为CXCL14、SAA1、ADGRL。DO富集表明上调基因可能主要与大疱性皮肤病相关,GO功能分析显示这些基因主要富集于细胞-细胞外基质黏着连接、调控成纤维细胞增殖的相关生物学功能、角蛋白丝、中间丝细胞骨架,KEGG富集显示这些基因可能与Notch信号通路、抗原处理和提呈、黑色素的形成、神经营养素信号传导通路、Wnt信号通路、钙离子信号通路、趋化因子信号通路等相关。这可能表明该群的上调基因主要通过调控相关信号通路进而影响VLS细胞骨架的构成、调节成纤维细胞的增殖。4.VLS皮损的血管内皮细胞群中,上调基因共8个,其中最可能与VLS发病机制相关的基因为ID3。DO富集表明上调基因可能与溃疡性结肠炎相关,GO和KEGG富集显示这些基因主要富集于白细胞迁移的负向调节、钙离子的释放、黑色素的形成、TGF-β信号通路、钙信号通路、趋化因子信号通路、Wnt信号通路。由此推测,该群的上调基因可能通过调控相关信号通路进而影响白细胞迁移和细胞激活、增殖,促进组织修复,从而调节VLS组织中的炎症反应。5.VLS皮损的成纤维细胞群中,上调基因共25个,最可能与VLS发病机制相关的基因为CLU、IGFBP、COL6A3。DO富集表明上调基因可能与肺癌相关,GO和KEGG富集显示这些基因主要富集于结缔组织发育、胶原组成的细胞外成分、抗原处理和递呈、趋化因子信号通路、mTOR信号通路、P53信号通路、Toll样受体信号通路。这可能表明该群的上调基因主要通过调控相关信号通路进而影响VLS细胞生长和增殖、细胞外基质构建和结缔组织发育。6.VLS皮损的T细胞群中,上调基因共69个,最可能与VLS发病机制相关的基因为PIP、TSHZ2、PDE3B。上调基因可能主要与淋巴细胞白血病、自身免疫性疾病、结核等相关,这些基因的主要集中于局部黏连组件的调控、细胞-基质交界处组件的调控、抗原处理和递呈、磷脂酰肌醇信号系统、神经活性配体-受体相互作用。推测该群的高表达基因可能通过调控细胞与细胞、细胞与细胞外基质的局部粘附而影响磷脂酰肌醇信号系统和神经活性,与VLS的发生发展有关。7.VLS皮损的黑素细胞群中,上调基因共39个,最可能与VLS发病机制相关的基因为CD74、HLA-DRB1、HLA-DRA。上调基因可能主要与肝炎、自身免疫性疾病（多发性硬化、Graves病、1型糖尿病等）相关。这些基因主要富集于IFN-γ介导的信号通路、抗原处理和递呈、Toll样受体信号通路、Jak-STAT信号通路、趋化因子信号通路。推测该群的高表达基因在VLS中可能主要参与抗原处理和递呈,调节IFN-γ介导的信号通路、Toll样受体信号通路,进而参与抗微生物、调节炎症反应的过程。8.VLS皮损的巨噬细胞群中,上调基因共66个,最可能与VLS发病机制相关的基因为CXCL10、FN1、CCL18。上调基因可能主要与肺部疾病有关。这些主要富集于对病毒的防御反应、抗原处理和递呈、Jak-STAT信号通路、趋化因子信号通路、细胞-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路等。推测该群的高表达基因在VLS中主要作用与处理递呈抗原、抗病原体、调节免疫反应有关。9.VLS皮损的树突状细胞群中,上调基因共38个,最可能与VLS发病机制相关的基因为IGKC、CXCL9、DCD。上调基因可能与特应性皮炎相关。这些差异基因主要富集于体液免疫反应、趋化因子活性、细胞因子-细胞因子受体的相互作用、Toll样受体信号通路。推测该群上调基因可能主要与黑素细胞、巨噬细胞共同发挥抗感染、调节免疫反应的作用。10.VLS皮损的肥大细胞群中,上调基因共22个,最可能与VLS发病机制相关的基因为MUCL1,PIP,HES1。上调基因可能主要与淋巴细胞白血病有关。这些基因主要富集于神经胶质细胞增殖和趋化因子产生的调控、抗原的处理和呈递、Notch信号通路、Toll样受体信号通路、趋化因子信号通路。推测这些基因的高表达可能主要通过影响VLS中神经细胞的增殖、趋化因子的产生进而影响本病的发生发展。结论:1.进展期生殖器LS与生殖器外LS之间在临床症状及毛囊角栓、棘层肥厚、血管扩张和嗜酸性粒细胞浸润等病理改变中均有一定差异。2.VLS皮损组织中的角质形成细胞、内皮细胞、成纤维细胞、T细胞、黑素细胞、巨噬细胞、树突状细胞和肥大细胞均存在较正常外阴皮肤的上调表达的差异基因。3.VLS可能与大疱性皮肤病、溃疡性结肠炎、肺癌、淋巴细胞白血病、自身免疫性疾病、肝炎、特应性皮炎存在关联。4.VLS中成纤维细胞、黑素细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞可能共同参与调控Toll样受体信号通路,从而影响促炎因子、抗炎因子和趋化因子的产生以引起局部炎症、调节免疫应答。