论文部分内容阅读
目的：观察氟以及外源性重组人骨形态发生蛋白2(Recombinant human bonemorphogenetic proteins2，rhBMP-2)诱导的类成骨细胞系SaOS-2(Humanosteoblast-like cell)成骨分化过程中SMADs信号蛋白的表达情况，为揭示氟骨症发生的分子机制提供基础。 方法：采用人类成骨肉瘤细胞系SaOS-2，分别用0mg/L、2 medL、4 mg/L、8 mg/L、16 mg/L、32 mg/L的氟刺激细胞24h、48h、72h，用0ng/ml、2ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的rhBMP-2处理细胞12h，以CCK-8法分别测定细胞的增殖情况；以实时荧光定量PCR的方法测定SaOS-2细胞在氟以及rhBMP-2作用下，成骨分化指标骨钙素(Osteocalcin，BGP)和骨碱性磷酸酶(Bone alkaline phosphatase，BALP)mRNA的表达情况；采用免疫荧光和免疫印迹法观察SaOS-2细胞在氟及rhBMP-2诱导的成骨分化过程中SMADs信号蛋白表达的变化情况；构建靶向SMAD4基因的shRNA质粒表达载体，转染后采用实时荧光定量PCR的方法检测对SMAD4基因表达的抑制情况；实时荧光定量PCR的方法检测shRNA沉默SMAD4基因后对氟及rhBMP-2诱导的SaOS-2细胞成骨分化过程的影响。 结果： 4～16mg/L的氟对SaOS-2细胞有刺激增殖的作用，4mg/L氟作用72h对SaOS-2细胞增殖作用效果明显(P<0.01)；2ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的rhBMP-2刺激SaOS-2细胞12h均能对细胞增殖起促进作用。 4mg/L的氟作用于SaOS-2细胞72h，能促进BALP和BGP mRNA表达量升高，与对照组相比差别均具有统计学意义(P均<0.05)；200ng/ml的rhBMP-2作用12h，SaOS-2细胞BGP以及BALP活性明显增强，与对照组相比较差别具有统计学意义(P均<0.05)。 在氟或rhBMP-2诱导的SaOS-2细胞成骨分化过程中，P-SMAD1/5蛋白表达量与对照组相比明显增高，免疫荧光结果显示差别具有统计学意义(P<0.05)。 实时荧光定量PCR结果显示：与空白对照及Mismatch shRNA组比较，shRNA1，shRNA2，shRNA3组SMAD4 mRNA表达均下降，其中shRNA3组下降最为明显(P<0.05)。 荧光定量PCR结果显示SMAD4.shRNA转染后，SaOS-2细胞BGP以及BALP活性明显降低，与对照组相比较差别具有统计学意义(P<0.05)，再使用4mg/L的氟刺激72h或用200ng/ml的rhBMP-2作用12h，BGP以及BALP表达与对照组相比较仍明显降低，差别具有统计学意义(P<0.05)。 结论： 4mg/L氟作用72h对SaOS-2细胞增殖作用效果明显。外源性的rhBMP-2作用12h可促进SaOS-2细胞增殖，4mg/L的氟刺激72h或200ng/ml的rhBMP-2刺激12hSaOS-2细胞成骨分化活性指标BALP和BGP表达明显增强，在氟或rhBMP-2诱导的SaOS-2细胞成骨分化过程中，BMP/SMADs信号通路参与并起到了一定的信号传递继而调节下游目的基因表达的作用，SMAD1/5的磷酸化在这个过程中发挥着重要的作用。