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背景与研究目的肾癌是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤,发生率排名居人类恶性肿瘤第十四位。它起源于肾小管上皮细胞,以透明细胞癌最常见,占肾细胞癌的70%-80%,另外还有乳头状癌、嫌色细胞癌等。目前肾癌病因尚未明确,有资料显示其发病与吸烟、解热镇痛药、激素、病毒、咖啡镉等有关。其中吸烟是已知最明确的危险因素,据推测20%-30%的男性和10%-20%的女性肾癌的发生是由吸烟引起。我国是世界上最大的烟草生产和消费国,吸烟引发的肿瘤及相关疾病,已成为国民健康的严重威胁。上皮间质转化在细胞恶转及肿瘤转移过程中起到至关重要的作用。本课题通过体外实验研究吸烟暴露对人肾癌细胞上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响,并探讨ERK5信号通路在吸烟暴露诱导肾癌细胞的EMT中的作用。方法建立体外细胞吸烟处理模型;MTT法筛选对肾癌细胞ACHN、A498细胞活力无明显影响的香烟悬液(cigarette smoking extract,CSE)浓度,后根据筛选结果选择相应浓度CSE处理肾癌细胞。(1)通过显微镜观察CSE对肾癌细胞形态的影响并记录;(2)通过transwell实验、划痕实验观察CSE能否引起肾癌细胞侵袭、转移能力改变;(3)运用western blotting、免疫荧光检测上皮间质转化相关分子标志物的变化;q RT-PCR方法检测CSE对肾癌细胞上皮间质转化相关标志物m RNA表达水平的影响;(4)用western blotting检测吸烟处理对肾癌细胞ERK5通路及AP-1通路活性的影响;(5)ERK5通路特异性抑制剂XMD8-92处理细胞,检测其对吸烟诱导的肾癌细胞ACHN、A498上皮间质转化的干预效果。结果(1)通过MTT法筛选适宜浓度的CSE作为实验浓度(0%、0.1%、0.25%、0.5%),当CSE浓度在0.75%及以上时,细胞活力明显受到影响,并具有统计学差异(P<0.05);(2)CSE处理肾癌细胞6天后,镜下观察细胞由原来的聚集变的更为分散,形态由原来的扁椭圆形变为长梭形,部分细胞伸出伪足;划痕实验、transwell实验表明,经CSE处理后肾癌细胞转移侵袭能力明显增强。(3)western blotting、免疫荧光检测发现肾癌细胞经CSE处理后,上皮标志物E-Cadherin、ZO-1表达水平呈上调趋势,间质标志物vimentin、N-cadherin表达水平呈下调趋势;同时,经q RT-PCR证实,上述相关标志物的m RNA表达水平亦表现相同的变化趋势。(4)通过western blotting检测发现,磷酸化ERK5(phosphorylated ERK5,P-ERK5)水平呈明显上升趋势,而总ERK5(total ERK5,T-ERK5)呈明显下降趋势;AP-1通路中磷酸化c-jun(phosphorylated c-jun,p-c-jun)、磷酸化c-fos(phosphorylated c-fos,p-c-fos)表达水平呈上升趋势。可见,吸烟处理可激活ERK5通路。(5)ERK5通路特异性抑制剂XMD8-92可逆转吸烟诱导的肾癌细胞上皮间质转化过程,表现如下:细胞形态上,由间质表型向上皮表型转变,且细胞重新表现相互聚集状态;划痕实验及transwell实验见细胞转移侵袭能力出现逆转;EMT相关标志物,上皮标志物E-cadherin、ZO-1表达水平上升,而间质标志物间质标志物vimentin、N-cadherin表达水平下调,相关标志物m RNA表达水平也表现相应的变化趋势。结论吸烟暴露可诱导肾癌细胞ACHN、A498发生上皮间质转化,ERK5信号通路在这一变化过程中起重要的正调控作用,ERK5通路的抑制可阻止这样变化的发生。这也进一步证实了,ERK5在吸烟引起的肾癌转移侵袭过程中起重要作用。