甘草和人参不定根代谢调控及糖基转移酶UGT71A29的功能研究

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甘草和人参都属于大宗类药材,应用十分广泛。本论文建立了甘草和人参不定根系,采用添加非生物和生物诱导子的方法,对培养物中甘草酸和人参皂苷进行代谢调控及机理研究,显著提高了其活性成分含量。此外,对人参中糖基转移酶功能进行研究,进一步揭示了人参皂苷生物合成途径。1.采用随机扩增多态性DNA(RAPD)方法证实了甘草不定根具有较高的遗传稳定性。组织学分析表明甘草不定根的纤维、导管、草酸钙、木栓细胞比栽培甘草要小。甘草酸、甘草次酸、总黄酮含量在栽培甘草中最高,其次是间接诱导的甘草不定根。相关性分析表明甘草酸含量与3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)和β-香树素酶(β-AS)表达呈显著正相关。2.采用非生物诱导子对甘草不定根进行代谢调控。与单一诱导相比,茉莉酸甲酯(MJ)和苯丙氨酸(PHE)混合诱导可以显著提高甘草不定根中甘草酸(0.36 mg·g-1)和甘草次酸(0.22 mg·g-1)含量。通过转录组测序,相关性分析等手段推测:MJ与AP2-EREBP家族转录因子Cluster-30944.55070作用,通过调控法呢基二磷酸酶(FPS),鲨烯环氧(SE)和糖基转移酶UGT(Cluster-30944.25725)基因提高了甘草酸和甘草次酸含量。3.采用生物诱导子对甘草不定根进行代谢调控。从季也蒙毕赤酵母Meyerozyma guilliermondii分离纯化出responsive protein LSP1可以显著提高甘草中活性成分含量,总黄酮(3.46 mg·g-1)、甘草酸(0.41 mg·g-1)、甘草次酸(0.41mg·g-1)和多糖(94.49 mg·g-1)分别为对照组的1.6,3.4,2.4,2.0倍。LSP1通过刺激信号分子、蛋白激酶(MAPK)、抗性蛋白和功能基因显著提高了甘草中三萜类皂苷的含量。4.采用人参病原菌及其抗性菌对人参不定根进行代谢调控。研究发现200mg/L青霉菌Penicillium sp.YJM-2013可以显著提高人参不定根中人参皂苷含量(48.95 mg·g-1),为对照组的2.59倍。Penicillium sp.YJM-2013通过激活信号分子、转录因子PgWRKY 1,2,3,5,7,9以及功能基因的表达,提高了人参不定根中人参皂苷的含量。5.对人参中分离的糖基转移酶UGT71A29的功能进行了验证。通过酿酒酵母体外实验和人参细胞体内实现发现:UGTPg71A29可以催化Rh1的20位糖基化形成Rg1,也可以催化Rd糖基化形成Rb1。同源建模、分子动力学以及突变分析发现283位谷氨酰胺是UGTPg71A29的关键催化位点。以上研究为通过生物技术生产甘草酸和人参皂苷奠定了基础。
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