目的小胶质细胞(microglia,MG)是一种广泛分布于中枢神经系统内的具有吞噬作用的神经胶质细胞,呈阿米巴样,起源于血循环中的单核细胞,对神经元起支持作用,是中枢神经系统中最主要的一道免疫防线。小胶质细胞在机体中枢神经系统未受损伤时呈静止状态,当中枢神经系统受损时,被激活的小胶质细胞具有非特异性吞噬包括凋亡的神经元在内等异物的能力。当损伤痊愈后,它们又恢复为静止状态,此时的小胶质细胞不具有吞噬能力。癫痫是一种由于脑内神经元突然异常放电所引起的短暂性大脑功能失常的疾病。癫痫发作过程中使神经元上的膜电位由静息状态转变为动作电位,并刺激神经元由突触前膜大量释放神经递质与相应的突触后膜受体结合,使神经元处于持续兴奋状态,并加快了神经元的凋亡。在癫痫发生的同时,体内的小胶质细胞被激活发挥起吞噬作用,及时清除非正常死亡的神经细胞及癫痫发作过程中产生的毒性物质,对维持机体内环境的相对稳定发挥着重要作用。被激活的小胶质细胞数目增多,胞体变大,突起增多。通过研究小胶质细胞的活化水平,可以间接的反应癫痫持续发作对神经元的损伤水平。癫痫持续发作的时间长短不一,小胶质细胞的活化程度也存在差异,具体见后面的实验结果。Purα是一种广泛存在于机体内能够与单链DNA和RNA高度亲和的蛋白质,对DNA复制、转录、RNA的转运以及蛋白质的翻译等过程具有调节作用。此外,Purα参与DNA的损伤与修复过程。Purα在神经元胞质中含量很多,最近的研究发现Purα在神经元发育过程中发挥着重要的作用,一些神经退行性疾病也与P urα的表达有关。本研究旨在探讨Purα对BV2细胞P2Y12受体表达的作用;以及大鼠在急性癫痫状态下小胶质细胞的活化与P2Y12受体的表达研究,和Purα对P2Y12表达的影响。方法1.大鼠癫痫模型的构建:采用的是氯化锂-匹罗卡品大鼠癫痫模型,该方法成功率高。2.慢病毒动物模型的构建:在立体定位仪下,分别给Purα过表达组和Purα沉默组大鼠的海马组织CA1区准确用微量注射器注入20μl的Purα沉默慢病毒载体pLKO.1-Purα和Purα过表达慢病毒载体pCDH-EF-1 Purα。饲养15天后,取脑片在荧光显微镜下观测其表达情况。3.Purα过表达慢病毒载体和Purα沉默慢病毒载体的包装:慢病毒包装质粒pCMV-DR8.2 dvpr,pCMV-VSV-G均为本实验室保存,慢病毒的包装按吉凯生物公司的慢病毒包装说明书进行,成功构建了Purα沉默慢病毒载体pLKO.1-Purα和Purα过表达慢病毒载体pCDH-EF-1 Purα。4.免疫组织化学:(1)取各个时间点癫痫组和正常对照组的大鼠脑组织,用免疫组织化学方法检测大鼠海马区小胶质细胞的活化情况。(2)取慢病毒组、正常对照组、生理盐水组大鼠在癫痫持续2h下的脑组织,用免疫组织化学方法检测大鼠海马区小胶质细胞的活化情况。以上检测所用到的一抗均为IBA1兔多克隆抗体。5.蛋白免疫印迹(Western blotting):(1)提取Purα空载体、Purα过表达和Purα过沉默质粒转染的BV2细胞蛋白,约60μg总蛋白,在翻译水平上检测P2Y12受体Purα的表达;(2)提取在癫痫持续发作各个时间点以及正常对照组动物模型的海马组织蛋白,约50μg总蛋白,进行常规蛋白免疫实验;在翻译水平上检测P2Y12受体、CREB和Purα的表达;(3)提取慢病毒组和正常对照组大鼠在癫痫持续2h时的海马组织蛋白,约50μg总蛋白,进行常规蛋白免疫实验,在翻译水平上检测P2Y12受体、CREB和Purα的表达。结果1.氯化锂-匹罗卡品大鼠癫痫模型构建成功,癫痫发作等级均达到实验所需的癫痫大发作的标准。2.Purα过表达慢病毒在大鼠海马区表达。3.小胶质细胞在癫痫持续发作过程中活化,癫痫持续时间不同,小胶质细胞活化的水平也存在差异,癫痫持续2h的时候小胶质细胞活化最为明显。相比较正常对照组,癫痫2h组的小胶质细胞数量多;活化的小胶质细胞胞体体积大,分支多,突起数目多。4.Western blotting结果显示:(1)Purα过表达组的P2Y12受体分别在BV2细胞和癫痫组大鼠海马组织中的表达水平均高于空载体组和对照组;(2)选取的癫痫0h,1h,2h,3h,4h等5个癫痫持续时间点,P2Y12受体和Purα均在癫痫持续3h时其表达水平最高;CREB在癫痫持续1h时表达水平最高,其原因未知。结论1.癫痫持续状态诱导小胶质细胞发生了活化;且小胶质细胞活化的程度和癫痫持续的时间有关。2.癫痫持续发作的时间不同,P2Y12受体、Purα、CREB的表达水平也存在差异。3.Purα对于P2Y12受体的表达具有上调作用。