【摘 要】
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金线莲（Anoectochilus roxburghii）为兰科开唇兰属植物,植株小巧,叶型独特,具有美丽的金黄色网状叶脉,不仅具有药用保健价值,还具有观赏价值。但目前对金线莲叶片呈色机制尚无研究,花青素是植物呈色的关键因素,且具有良好的抗氧化和增强免疫力的作用。二氢黄酮醇-4-还原酶（DFR）是花青素后期合成途径中导向花青素合成的一个关键的特异性酶。本论文从转录组测序结果中筛选拟参与花青素合成的
【基金项目】
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浙江省重点研发项目（2017C02012）-金线莲等名贵药材种苗繁育及高效栽培技术研究项目；
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金线莲（Anoectochilus roxburghii）为兰科开唇兰属植物,植株小巧,叶型独特,具有美丽的金黄色网状叶脉,不仅具有药用保健价值,还具有观赏价值。但目前对金线莲叶片呈色机制尚无研究,花青素是植物呈色的关键因素,且具有良好的抗氧化和增强免疫力的作用。二氢黄酮醇-4-还原酶（DFR）是花青素后期合成途径中导向花青素合成的一个关键的特异性酶。本论文从转录组测序结果中筛选拟参与花青素合成的候选基因、克隆拟参与花青素合成的DFR基因,通过烟草遗传转化并分析其功能。主要研究结果如下:通过NCBI Blast比对,从金线莲转录组测序结果中筛选出拟参与花青素生物合成的14个基因(E<10-5)。基于“基因-代谢物”相关性分析,筛选到Ar CHS2、Ar CHS6、ArDFR1、ArDFR3、Ar FLS2为花青素合成途径中的关键酶基因。RACE扩增ArDFR1和ArDFR3全长cDNA序列,全长分别为1356 bp和1334 bp,分别编码282和348个氨基酸组成的ArDFR1和ArDFR3蛋白。生物信息学分析结果表明:ArDFR1和ArDFR3为稳定的亲水性酸性蛋白,无信号肽,具有NADP（H）结合位点和底物结合区域,属于NADP（H）依赖的短链脱氢酶（SDR）超基因家族的二氢黄酮醇-4-还原酶。ArDFR1定位于细胞质,ArDFR3定位于细胞器膜上。进化树分析发现ArDFR1和ArDFR3与铁皮石斛、蝴蝶兰、香荚兰、深圳拟兰等单子叶植物亲缘关系较近。构建PCAMBIA1381Z-ArDFR1/PCAMBIA1381Z-ArDFR3重组载体,通过农杆菌介导的烟草遗传转化方法分别获得含有ArDFR1和ARDFR3编码基因的阳性植株64株和32株;转基因植株表达ArDFR1和ArDFR3编码基因的叶片中的花青素含量最高分别为0.445 mg/g和0.408 mg/g,较野生型分别提高了5.86倍和5.37倍,且花瓣颜色较野生型烟草明显加深。
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