产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是新生仔猪和断奶仔猪腹泻的主要病原体，也是仔猪腹泻的重要诱因，其中以F4~+ETEC占据优势地位，因此控制F4~+ETEC感染成为防治仔猪腹泻关键一环。仔猪腹泻是长期困扰猪场和养殖户的一个难题，不仅带来直接的死亡损失和大量的药费开支，还间接影响到康复猪下一阶段的生长速度、育成率，危害相当严重，成为全球范围内影响提高养猪业经济效益的重要制约因素。本研究首先克隆了F4~+ETEC FaeG、STa-LTB、STb基因，采用融合PCR或SOE-PCR方法，克隆获得优化组合的新的F4~+ETEC保护性抗原基因STa-LTB-STb-FaeG，在此基础上引入M细胞靶向肽co1，获得靶向M细胞的基因STa-LTB-STb-FaeG-co1，之后构建表达FaeG、FaeG-co1、STa-LTB-STb-FaeG、STa-LTB-STb-FaeG-co1的重组大肠杆菌。SDS-PAGE和Westernblot分析显示融基因大肠杆菌获得了高效表达。重组表达的目的蛋白STa-LTB-STb-FaeG、STa-LTB-STb-FaeG-co1、FaeG、FaeG-co1主要以包涵体的形式存在，提取包涵体，免疫试验小鼠，测定血清中特异性IgG抗体水平，并用大肠杆菌强毒株对免疫鼠进行攻毒试验。证实目的蛋白无毒性，可诱导产生保护性免疫反应，M细胞靶肽修饰的重组蛋白诱导免疫小鼠产生的特异性IgG抗体水平明显高于未修饰组；M细胞靶向修饰组通过两次免疫可抵抗大肠杆菌强毒株（1×10~9CFU/只）攻击，保护率达到100%。这些结果表明所构建的保护性抗原是安全有效的，M细胞靶向肽对抗原具有免疫增强作用。以筛选到的免疫保护性抗原蛋白的基因FaeG、FaeG-co1、STa-LTB-STb-FaeG （以下简称SLSF）、STa-LTB-STb-FaeG-co1（以下简称SLSF-co1）为靶基因，分别亚克隆到分泌表达型乳酸菌载体pPG-2中，电转化后，构建了表达F4~+ETEC免疫保护性抗原蛋白的重组干酪乳杆菌表达系统，重组干酪乳杆菌分别命名为pPG-2-FaeG/L.casei393、pPG-2-FaeG-co1/L.casei393、pPG-2-SLSF/L.casei393、pPG-2-SLSF-co1/L.casei393。将获得的重组干酪乳杆菌以1%乳糖为诱导剂进行诱导表达，Western blot实验表明，重组的目的蛋白获得了表达。为探讨表达F4~+ETEC免疫保护性抗原蛋白的重组干酪乳杆菌系统作为活菌疫苗潜在的应用价值，本实验以成年和哺乳期BALB/c小鼠为实验动物，进行免疫原性评价研究。分三种不同的免疫程序进行免疫，分别为一次免疫组、三次免疫组及哺乳期小鼠免疫组，口服接种10~9活菌量，以PBS、pPG-2/L.casei393组作为对照。免疫后收集不同时间段免疫小鼠新鲜粪便、血液、鼻腔冲洗液、外生殖道冲洗液等样品，分别测定样品中特异性sIgA以及小鼠血清中IgG。通过流式细胞术的方法检测Th1、Th2、Th17的表达水平，MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况。口服免疫效果表明，一次免疫组pPG-2-FaeG/L.casei393和pPG-2-FaeG-co1/L.casei393在一免后第7d即可在血清、粪便及外生殖道中检测到较高水平的IgG、sIgA抗体，与对照组相比差异极显著（P<0.01），M细胞靶向修饰组pPG-2-FaeG-co1/L.casei393的免疫效果明显高于未修饰组；三次免疫组pPG-2-SLSF/L.casei393和pPG-2-SLSF-co1/L.casei393在粪便、外生殖道及鼻腔冲洗液中均能检测到高水平的sIgA抗体，并可检测到高水平血清IgG抗体，组间差异极显著（P<0.01），与对照组差异极显著（P<0.01）；哺乳期小鼠免疫组pPG-2-SLSF/L.casei393和pPG-2-SLSF-co1/L.casei393在二免后第7d即可在血清、粪便及外生殖道中检测到较高水平的IgG、sIgA抗体，组间差异显著（P<0.05），与对照组差异极显著（P<0.01）。以上结果表明，重组干酪乳杆菌表达系统能够刺激动物产生粘膜免疫应答和系统免疫应答，其中M细胞靶向修饰组的抗体水平明显高于未修饰组。攻毒试验结果表明，一次免疫（one dose）攻毒后，pPG-2-FaeG/L.casei393组小鼠排粪量明显增多，攻毒后第2d出现水样便，在攻毒后4d天有一只死亡，第5d排粪便量逐渐减少，第9d恢复正常，保护率90%，在攻毒后第10d粪便中检测不到F4~+ETEC菌株；pPG-2-FaeG-co1/L.casei393组攻毒后排粪便量增多，第4d排粪便量逐渐减少，第7d恢复正常，保护率100%，在攻毒后8d粪便中检测不到F4~+ETEC菌株；而对照组小鼠在第2d、3d全部死亡。三次免疫效果分析显示，对照组小鼠在第2d、3d全部死亡的情况下，pPG-2-SLSF/L.casei393组小鼠在攻毒后排粪量增多，第2d出现黏液便，从第3d开始排稀粪量逐渐减少，第6d恢复正常，无一死亡，在攻毒后第7d粪便中检测不到F4~+ETEC菌株；pPG-2-SLSF-co1/L.casei393组小鼠排粪便量有轻度的增加，第4d恢复正常，无一死亡，在攻毒后第5d粪便中检测不到F4~+ETEC菌株。对哺乳期小鼠免疫结果显示，对照组小鼠在第2d全部死亡；pPG-2-SLSF/L.casei393组小鼠在攻毒后排粪量明显增多，出现黏液便，第4d开始排粪便量逐渐减少，第7d恢复正常，保护率100%，在攻毒后第8d粪便中检测不到F4~+ETEC菌株；pPG-2-SLSF-co1/L.casei393组在攻毒后排粪量略有增多，第2d出现黏液便，第4d开始排粪便量逐渐减少，第6d恢复正常，保护率100%，在攻毒后第7d粪便中检测不到F4~+ETEC菌株。本实验构建了表达F4~+ETEC免疫保护性抗原蛋白的重组干酪乳杆菌表达系统，证实M细胞靶向策略在乳酸菌活载体疫苗系统中应用是确实可行的，说明所构建的重组干酪乳杆菌表达系统作为口服疫苗具有潜在的应用价值，为下一步开发新型ETEC口服疫苗奠定了基础，也为探索靶向传递抗原增强哺乳仔猪早期免疫应答水平实践与机理研究提供了基础材料。