目的 组织工程骨体外构建的研究已经很多，但是所利用的细胞外支架和天然的骨组织相比，仍有许多不足。骨脱细胞细胞外基质(AECM)是利用物理和化学的方法对骨组织进行处理而得到的无细胞的天然细胞外基质，其结构与天然骨组织十分相似。虽然，一些人描述了骨脱细胞细胞外基质的特性，说明它是一种较好的细胞外支架，但迄今为止还没有见到骨脱细胞细胞外基质作为支架与种子细胞联合培养的详细报道。成骨细胞是骨形成中必不可少的细胞，在体外具有培养方法简便、容易获得和扩增迅速的特性，是骨组织工程种子细胞的理想选择，但是对于它的成骨特性却未见较全面的描述。本实验以长骨干成骨细胞为种子细胞，进行培养并观察以及在体外与骨重组脱细胞细胞外基质进行联合培养，旨在为骨组织工程筛选种子细胞奠定基础，为组织工程骨体外构建提供科学实验依据。 材料和方法 1．动物wistar大鼠15只，体重180—200克左右，雌雄不限(中国医科大学动物部提供) 2．试剂DMEM(GIBCO／BRL)、胰酶(DIFCO)、小牛血清(TDB生物制品公司)、Collagen type Ⅰ抗体(武汉博士得生物制品公司) 3．骨重组脱细胞细胞外基质(Reconstructed Acellular Extra Cellular Matrix，REAECM)的制备 用1％的戊巴比妥钠(1.0ml／只)将5只wistar大鼠进行腹腔麻醉，取双侧胫骨中段。锯成若干段以后，剔除骨膜，PBS彻底清洗。向广口瓶中加人 0．05 M TiS－HCLhH7．4）缓冲液，缓冲液内加人蛋白酶抑制剂N．1吩d邓］ollilll．5伶d fenP…＊，o·6pyInl pepstatinA人放人骨片4t下恒温震荡4天。然后把瓶内液体换成内含3％TritonX－100的 TiS－HCLhH7．4）缓冲液，同样也加人上述蛋白酶抑制剂，斗℃下恒温震荡7天后，用蒸馏水连续冲洗。之后加人DNAse和NAse混合液室温下消化12 ／J＼时。再次向瓶中加人内含 3％TritonX河 的 TiS－HCL帅H7．4）缓冲液，4℃下恒温震荡7天。蒸馏水充分冲洗后，将制备的骨脱细胞细胞外基质（AECM）放人Von Ebnel氏脱钙液脱钙30天后，放人内含4万单位庆大霉素的PBS液中，4℃下保存备用。收集AECM于烧杯中，剪碎，匀浆机打碎，离心后弃去上清，将残留物放人24孔培养板的孔内，令其自然沉降干燥，制成骨的REAECM，然后放人90％的酒精中48小时后，紫外线照射3天备用，部分作光镜、扫描电镜观察。 4．成骨细胞培养及生物学活性检测 取 10只 wistar大鼠的双侧股骨中段，剥除骨膜，剪成 Inun x1＊m大小的组织块儿，放人0．25 ％的胰酶中，37℃的恒温水浴消化30分钟，连续5次，更新胰酶消化液，4℃冰箱中消化，过夜。再次更换胰酶消化液，37℃再消化2小时，将组织块取出移人培养瓶中，加人含 10％小牛血清的 DMEM，浸没，放人 37℃3％CO。培养箱中，隔日换一次液，待细胞长满瓶时，用0．25％的胰酶消化传代，取第四代细胞行MM法绘制生长曲线、HE、Mallory叶eiden－ham快速一步法、黄素红S、钙一钻法碱性磷酸酶染色以及免疫组化SP法检测1型胶原。 5．成骨细胞和骨REAECM体外联合培养 无菌条件下．用 0．25％的胰酶消化液消化第四代的成骨细胞，收集制成 IX 10‘什Inl的 DMEM细胞悬液。取 12孔培养板，将4块已消毒备用的骨的REAECM放人孔中，每个孔中放人细胞 ·2·悬液 lrnl，让成骨细胞充分渗人骨的 yAECM孔隙中，放人 37 t，5％CO。的培养箱中，6小时后更换培养液，以后每两天换一次液。 6．联合培养的组织学观察 联合培养1周后，将骨REAECM取出。部分骨REAECM以10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片，行HE染色。部分骨RE－AECM以 2．5％戊H醛固定，作扫描电镜观察。 结 果 二．骨REAECM的组织学观察 光镜下，和正常的骨组织HE切片相比较，骨脱细胞细胞外基质（AECM）胶原纤维排列整齐，椭圆形骨陷窝内空虚，无骨细胞核及其他结构。经物理处理的骨的REAECM扫描电镜观察仅见骨基质结构，细胞结构已经消失，骨陷窝空虚，骨陷窝内壁光滑规则，无任何细胞残留物，而且骨REAECM具有不规则的孔隙一网架结构，孔隙直径为 100－400卜m，孔壁欠光滑，孔隙率高，这与 RE－AECM的HE染色的结果是一致的。 2．成骨细胞的生长特性及组织学观察 骨组织块消化后浸泡于培养瓶内，24小时后，开始有细胞出现；以后，细胞不断从骨块中爬行出来，可见细胞呈梭形、鳞片状或三角型。培养3周后，可见明显的集落形成。集落中的细胞不断扩增，呈放射状向周围扩展。传代细胞自 2－6h开始贴壁，12－14h大部分开始分裂生长，与原代细胞相似，46天即可长满培养瓶。成骨细胞的碱性磷酸酶染色为强阳性，黄素红染色阳性，而免疫组化和nanory一nei咖nnatn快速一步法结果是一致的。 3．成骨细胞和骨的REAECM联合培养的光镜观察 联合培养1周的组织学切片显示，在骨的REAECM的孔隙中，有成团的蓝染的成骨细胞，有的细胞沿着骨REAECM排列