研究背景Graves眼病(Graves’ ophthalmopathy, GO)是一种器官特异的自身免疫性疾病,其组织学特征是眶周组织淋巴细胞浸润。眶周的T细胞、巨噬细胞合成并释放大量的细胞因子到组织中,该免疫过程可直接导致纤维细胞增生,葡糖胺聚糖合成等一系列生物反应。Graves眼病可出现一系列临床表现,如眼痛、眼球突出、眶周水肿、眼外肌运动障碍、炎症及损害视力等。大约有20-25%的甲状腺机能亢进的病人发生Graves眼病。Graves眼病发病的机制至今仍不是十分清楚,临床治疗也有一定困难。现在的观点认为：Graves眼病的发病是一种多基因遗传、多因素作用参与的T细胞免疫介导性疾病,其发病机制复杂。其中CD4+淋巴细胞免疫功能异常在其发病中尤为重要。CD4+辅助性T细胞(helper T cells, Th)是一类重要的免疫调节细胞,它对维持机体的免疫平衡发挥重要作用。传统观念将CD4+Th细胞分为Thl和Th2两类细胞亚群。Thl分泌IFN-γ和IL-12等细胞因子,在清除胞内菌时起重要作用；而Th2分泌IL-4、IL-2等细胞因子,主要影响寄生虫和胞外菌的清除,IFN-γ和IL-4分别是Thl和Th2细胞亚群标志性细胞因子。最近,CD4+Th细胞家族新型成员----Th17细胞亚群的发现,改写了经典的Thl/Th2细胞免疫模式,在维持机体免疫平衡方面发挥重要作用,是对Thl/Th2免疫平衡理论的重要补充。这类细胞主要以分泌IL-17(IL-17A)、IL-17F、IL-21、IL-22等细胞因子为特征,其增殖、分化过程需要IL-6和TGF-β的参与,并且需要STAT3依赖性的转录因子ROR γ t、ROR α的表达。Th17细胞免疫反应在肿瘤免疫以及多种自身免疫性疾病的免疫发病过程中发挥重要作用。IL-23主要作用于Th17细胞,维持其表达,研究证实IL-23刺激Th17细胞的扩增和维持。IL-23在Th17细胞的诱导分化中起了很重要的强化和稳固作用,Th17细胞通过分泌包括IL-17在内的多种细胞因子参与炎症反应,部分学者提出自身免疫性炎症的IL-23/IL-17轴的重要作用理论。Graves眼病的病程经历两个阶段：早期为活动期,主要病理表现为眼部淋巴细胞和炎性细胞的浸润、氨基葡聚糖的沉积与水肿；晚期为稳定期,表现为球后组织的纤维化及脂肪的沉积。病程不同时期Graves眼病患者采取的治疗方法和疗效不同,因此正确评判Graves眼病的病情对治疗方法的选择和预后的估计有重要意义。目前Graves眼病眼病的免疫治疗,最基本最常用的是糖皮质激素的应用。大量证据表明,糖皮质激素对中重度浸润性突眼的治疗尤其有效,中重度及活动性Graves眼病患者静脉使用糖皮质激素类药物的有效率可达77%。Graves眼病治疗时口服制剂多使用强的松,静脉制剂多使用甲基强的松龙。甲基强的松龙是肾上腺糖皮质激素,具有多方面生理功能,对免疫反应的许多环节都有抑制作用。本研究拟观察Graves眼病患者Th17细胞在外周血PBMC的比例及相关细胞因子的表达,并评价其与Graves眼病临床相关性及意义,并观察糖皮质激素(甲强龙)作用于Graves眼病患者PBMC时对Th17细胞及相关细胞因子的影响作用,进一步探讨糖皮质激素(甲强龙)治疗Graves眼病新的作用机制。第一章Graves眼病患者外周血Thl7细胞及相关细胞因子的变化及临床意义目的通过检测Graves眼病患者外周血中的的Th17细胞及相关细胞因子IL-6、IL-17、IL-23的表达水平,探讨Graves眼病与正常人之间以及Graves眼病不同期患者之间Th17细胞及相关细胞因子表达的差异及其临床相关性,初步明确Th17细胞在Graves眼病发病中的作用机制及临床意义。方法(1)选取未经治疗的Graves眼病患者(GO组)40例,根据临床活动性评分(CAS)将Graves眼病患者分为活动性GO组20例(CAS≥3),非活动性GO组20例(CAS<3)；同时选取未经治疗的同期非突眼Graves病患者(GD组)20例及健康体检的正常对照组20例。(2)流式细胞术检测外周血单个核细胞(PBMC)中Th17细胞表达水平,双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中IL-6、IL-17、IL-23的表达水平,并分别与CAS评分、TSH、FT3、FT4、TRAb、突眼度等临床或实验室指标进行相关性分析。(3)统计分析方法：采用SPSS16.0统计处理软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,单变量两组资料之间的比较采用t检验,多组资料之间的比较采用单因素方差分析,方差齐时,多重比较采用LSD法,方差不齐时进行Welch法校正,采用Dunnett’s T3法进行组间多重比较。正态分布资料的相关分析采用Pearson相关分析,不符合正态分布的资料用Spearman等级相关分析。以α=0.05作为检验水准,P<0.05为差异具有统计学意义。结果(1)流式细胞染色示：GO组患者Th17细胞比例较正常对照组升高,差异有统计学意义(1.24±0.18%vs0.55±0.09%P<0.05；0.99±0.13%vs0.55±0.09%P<0.05)。活动性GO组患者Th17细胞比例高于非活动性GO组(1.24±0.18%vs0.99±0.13%；P<0.05)和GD组(1.24±0.18%vs0.97±0.16%；P<0.05)；而非活动性GO组患者Th17细胞比例与GD组差异无统计学意义(P>0.05)。相关性检验分析显示GO组患者Th17细胞表达水平与临床活动性评分(CAS)呈正相关(P<0.05),而与TSH、FT3、FT4、TRAb、突眼度之间均无显著性关联(P>0.05)。(2) ELISA检测结果示：GO组患者血清中IL-6、IL-17、IL-23的表达水平高于正常对照组(P<0.05)。活动性GO组患者IL-17、IL-23的表达水平高于非活动性GO组和GD组(P<0.05)；而非活动性GO组患者IL-17、IL-23表达水平与GD组差异无统计学意义(P>0.05)。IL-6在GO组、GD组和正常对照组三组间差异无统计学意义(P>0.05)。相关性检验分析显示GO组患者IL-17、IL-23的表达水平与临床活动性评分(CAS)呈正相关(P<0.05),而与突眼度、实验室检查指标(TSH、FT3、FT4、TRAb)之间均无显著性关联(P>0.05)。结论GO组患者Th17细胞及相关细胞因子IL-6、IL-17、IL-23的表达水平高于正常对照组,且活动期患者高于非活动期患者,并与临床活动性评分(CAS)呈正相关,提示Th17细胞及相关细胞因子可能在GO的发生发展中起重要作用,可望作为评价GO患者病情活动性的新指标。第二章Graves眼病患者外周血Th17细胞相关基因IL-17、ROR γ t mRNA的表达及临床意义目的研究Graves眼病患者外周血Thl7细胞相关基因IL-17、ROR γ t mRNA的表达及其在疾病不同时期的差异,并分析临床相关性,从而进一步探讨Th17细胞在Graves眼病发病机制中的作用。方法(1)选取未经治疗的Graves眼病患者(GO组)40例,根据临床活动性评分(CAS)将Graves眼病患者分为活动性GO组20例(CAS≥3),非活动性GO组20例(CAS<3)；同时选取同期未经治疗的非突眼Graves病患者(GD组)20例及健康体检的正常对照组20例。(2)实时荧光定量PCR检测外周血单核细胞(PBMC)中IL-17、ROR γt mRNA的表达水平,并分别与CAS评分、突眼度、FT3、FT4、TSH、TRAb等临床或实验室指标进行相关性分析。(3)统计分析方法：采用SPSS16.0统计处理软件进行统计分析。计量资料实验数据以均数±标准差(x±s)表示,多组资料之间的比较采用单因素方差分析,方差齐时,多重比较采用LSD法,方差不齐时进行Welch法校正,采用Dunnett’s T3法进行组间多重比较。正态分布资料的相关分析采用Pearson相关分析,不符合正态分布的资料用Spearman等级相关分析。以α=0.05作为检验水准,P<0.05为差异具有统计学意义。结果GO组和GD组患者外周血PBMC中IL-17、RORγt mRNA的表达水平均高于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),且活动性GO组患者IL-17、RORγt mRNA的表达水平高于非活动性GO组和GD组(P<0.05),而非活动性GO组患者外周血PBMC中IL-17、RORγt mRNA的表达水平与GD组差异无统计学意义(P>0.05)相关性检验分析显示RORγt与IL-17mRNA表达水平呈正相关,GO组患者RORγt、IL-17mRNA表达与临床活动性评分(CAS)呈正相关(P<0.05),而与突眼度、验室检查指标(FT3、FT4、TSH、TRAb)之间均无显著性关联(P>0.05)。结论GO组患者PBMC中IL-17、RORγt mRNA的表达水平高于正常对照组,且活动期患者高于非活动期患者,并与临床活动性评分(CAS)呈正相关,提示IL-17、RORγtmRNA的上调与GO的发生发展有关。第三章甲基强的松龙对活动性Graves眼病外周血Th17细胞及相关细胞因子的影响目的本研究通过在体外观察不同剂量甲强龙对活动性Graves眼病患者Th17细胞及相关细胞因子的影响,为临床使用甲强龙治疗活动性Graves眼病提供新的理论依据。方法(1)选取未经治疗的活动性Graves眼病患者及同期正常健康对照者各5例,分离PBMC,体外予不同浓度(0,1,5,25,125ug/m1)甲强龙培养12h,收集培养液上清。(2)流式细胞术检测甲强龙作用后的单核细胞(PBMC)中Th17细胞的比例,双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养液上清中IL-17的表达水平。(3)统计分析方法：本实验采用SPSS16.0统计处理软件进行统计分析。常规进行方差齐性检验,正态性检验。计量资料实验数据以均数±标准差(x±s)表示,单变量两组资料之间的比较采用t检验,综合不同组不同浓度甲强龙作用后的测量数据的比较采用重复测量方差分析。以α=0.05作为检验水准,P<0.05为差异具有统计学意义。结果(1)经重复测量方差分析,结果显示活动性GO组和正常对照组间差异有统计学意义(F=402.728,P<0.001),不同浓度组之间差异有统计学意义(F=50.870,P<0.001),分组与浓度之间有交互作用(F=4.208,P<0.001),提示不同组随着甲强龙浓度的增加,Thl7细胞的比例变化趋势不同。进一步对单独效应进行分析,结果显示两组在不同浓度甲强龙作用后差异均有统计学意义(P<0.05),两组内不同浓度间差异有统计学意义(P<0.05)。不同浓度(0,1,5,25,125ug/m1)甲强龙体外作用于活动性GO患者PBMC时,25、125ug/ml浓度组对Th17细胞有抑制作用,其余各浓度组均无抑制作用；甲强龙作用于正常对照组PBMC时,25,125ug/ml浓度组对Th17细胞有抑制作用。且甲强龙对Th17细胞的抑制作用随甲强龙浓度的增加而增强。(2)重复测量方差分析结果显示活动性GO组培养液上清IL-17水平高于正常对照组,差异有统计学意义(F=392.181,P<0.001),不同浓度组之间差异有统计学意义(F=28.691,P<0.001),分组与浓度之间存在交互作用(F=6.705,P<0.001),提示不同组随着甲强龙浓度的增加,培养液上清IL-17变化趋势不同,进一步对单独效应进行分析,结果显示两组在不同浓度甲强龙作用后差异均有统计学意义(P<0.05),两组内不同浓度间差异有统计学意义(P<0.05)。除甲强龙1ug/ml浓度组对活动性GO患者PBMC培养液上清IL-17的表达无抑制作用,其余各浓度组甲强龙体外均有抑制作用,差异有统计学意义(P<0.05)。甲强龙25、125ug/ml浓度组对正常对照组患者PBMC培养液上清IL-17的表达有抑制作用,其余各浓度组均无抑制作用(P>0.05)。结论甲强龙可抑制活动性Graves眼病的PBMC分泌IL-17水平和Thl7细胞的表达,此研究为糖皮质激素甲强龙的临床应用提供了理论基础和实验室依据。