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背景:弓形虫是一种专性的细胞内寄生虫,对胎儿造成不可逆的损害,对免疫功能低下的个体构成致命威胁。据统计,全球范围内约有1/3的人曾被弓形虫感染,而我国弓形虫感染率也达到了7.8%,并且有不断上升的趋势。弓形虫病在全球范围内都是一种重要的食源性疾病,不仅对人们的生命健康产生威胁,也造成严重的医疗卫生压力及社会经济负担。因此,食源性弓形虫病是一项影响全球人民健康的重要公共卫生问题。目的:弓形虫能够入侵所有温血动物,激活宿主免疫系统,但是其仍然能够在宿主中长期存活。天然免疫NF-κB信号通路在清除入侵弓形虫中发挥重要作用,但也有研究表明弓形虫能够抑制NF-κB信号通路的活化,从而抑制宿主免疫反应。弓形虫在细胞内形成纳虫空泡,干扰宿主细胞的信号转导,保护其免受宿主清除,在弓形虫繁殖过程中有着不可替代的作用,而致密颗粒蛋白对于纳虫空泡结构的稳定和功能的发挥有着至关重要的作用。目前关于致密颗粒蛋白在弓形虫免疫逃逸中的作用尚不十分清楚。因此,本课题主要研究弓形虫致密颗粒蛋白对天然免疫NF-κB信号通路的调控作用,并且深入探究这种调控的分子机制,为进一步阐明致密颗粒蛋白与弓形虫免疫逃逸的关系提供研究基础。方法:1.从实验室构建的33个弓形虫致密颗粒蛋白中,采用双荧光素酶报告基因检测方法筛选出对NF-κB信号通路有明显抑制作用的候选基因GRA14,从而进一步研究作用机制。2.采用双荧光素酶报告基因检测方法进一步确定GRA14对NF-κB信号通路抑制作用的特点。3.采用双荧光素酶报告基因检测和qPCR技术检测IL-6,IL-12,TNF-α,IFN-β,CXCL10和CCL5等NF-κB信号通路下游细胞因子和趋化因子的表达,确定GRA14对NF-κB信号通路下游基因表达的影响。4.采用双荧光素酶报告基因和western blot技术确定GRA14对NF-κB信号通路的作用的分子靶点。5.采用RNA测序分析GRA14对MyD88介导信号通路的基因转录水平的影响,并且采用qPCR技术进行了验证。结果:1.筛选发现GRA14对于NF-κB信号通路有明显的抑制作用,MyD88,cGAS-STING,MAVS,TRIF介导的NF-κB信号通路均能被GRA14抑制。2.GRA14除了抑制NF-κB信号通路,对AP-1信号通路也有明显的抑制作用,但是对ISRE通路的影响不显著。3.GRA14能够抑制通路下游IL-6,IL-12,TNF-α,IFN-β,CXCL10,CCL5的表达。4过表达TRAF2,TRAF6,TAB1,TAK1,IKKα,IKKβ,p50,p65这些NF-κB信号通路上的关键蛋白发现,GRA14均能够抑制NF-κB启动子的活性,说明GRA14抑制NF-κB通路的作用靶点可能是p65或p65下游。5.Western blot结果显示GRA14能够抑制p65的磷酸化并且能促进p65降解,对内源性和外源性p65均如此。核质分离结果显示GRA14能够抑制p65入核,并且主要定位于宿主细胞质中,细胞核中少量分布,说明GRA14可能通过促进p65降解,抑制其入核,阻止NF-κB通路的活化,从而调控宿主细胞免疫反应,实现免疫逃逸。6.RNA测序结果显示GRA14能够影响宿主细胞49个基因的表达,并且经qPCR验证GRA14能够下调HSPA1A,HSPA6,上调PAK6。HSPA1A和HSPA6是NF-κB信号通路下游转录因子,它们的表达下调,进一步说明了GRA14对NF-κB信号通路的抑制作用。PAK6与NF-κB信号通路的关系尚不清楚,需要进一步研究。PAK6与p38 MAPK通路相关,有可能通过p38 MAPK通路调控NF-κB活性,因此,GRA 14与PAK6、p38 MAPK及NF-κB的关系亟待深入探索研究。结论:弓形虫GRA14对NF-κB,AP-1信号通路均有抑制作用,同时抑制通路下游细胞因子的转录表达;弓形虫GRA14能够通过促进p65降解和抑制p65的磷酸化入核负调控NF-κB信号通路,从而调节宿主免疫,协助免疫逃逸。