单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,以下简称Lm)是一种人畜共患的革兰氏阳性致病菌,可以穿透人体的三大屏障——胎盘屏障、血脑屏障和肠道屏障,进而造成人体感染,死亡率达20%-30%。为深入解析Lm的致病机制及其与宿主之间的相互关系,本实验以Lm为对象,进行了以下两部分研究:(一)单核细胞增生李斯特菌棉铃虫感染模型的建立;(二)单核细胞增生李斯特菌膜囊泡的制备及功能探究。一、单核细胞增生李斯特菌棉铃虫感染模型的建立该部分利用棉铃虫幼虫作为探究Lm致病能力的昆虫模型,以期为进一步研究Lm与宿主之间的相互作用机制奠定基础。实验结果如下:首先,将5株不同毒力的Lm菌株分别腹腔微量注入4龄棉铃虫幼虫体内,随后统计幼虫的死亡率并计算菌株的半数致死量(LD50),观测幼虫中肠细胞的病理变化,测定虫体内的载菌量。以上5株Lm菌株为:野生株(EGDe,中毒)、PrfA缺失株(EGDeΔprfA,弱毒)、PrfA组成型高表达株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA*,高毒)、携带空载质粒的野生株(EGDe+pERL3,中毒)以及PrfA质粒高拷贝回复株(EGDeΔprfA+pERL3-prfA,高毒)。结果显示Lm不仅能成功侵染棉铃虫幼虫并可致其死亡,且其半数致死量以及对棉铃虫中肠细胞的损伤程度均与菌株毒力正相关。其次,通过检测棉铃虫在感染Lm后体内血细胞数量及包囊作用的变化,以及虫体内免疫相关基因在感染前后的表达水平差异,探究棉铃虫对不同毒力Lm菌株感染的免疫应答。结果显示高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*对棉铃虫幼虫免疫系统的影响最为强烈,不仅使其血细胞数量减少了 71%,同时显著抑制了血细胞的包囊作用,相较而言弱毒株EGDeΔprfA感染的棉铃虫血细胞仅减少27%,且对棉铃虫血细胞的包囊基本无抑制作用;另外RT-qPCR结果也显示感染了高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*的棉铃虫的HaCTL1以及HaPGRP-A的转录水平显著上调,且显著高于包括EGDeΔprfA+pERL3-prfA在内的其他Lm感染的棉铃虫,然而感染了弱毒株EGDeΔprfA的棉铃虫的相关基因转录表达尽管有上调但上调量并不显著。以上结果暗示了不同毒力Lm侵染棉铃虫幼虫后均可激活棉铃虫体内的天然免疫系统,且毒性越高的菌株对棉铃虫本身的伤害更大,引起的免疫反应也更强烈。除此之外,还检测了不同毒力Lm菌株在棉铃虫体内的溶血活性水平以及相应虫体的谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)的活性高低,探究Lm对棉铃虫的毒性与棉铃虫自身解毒作用之间的关系。结果显示高毒株EGDeΔprfA+pERL3-prfA*对棉铃虫幼虫的致病性最强,同时一定程度上抑制了虫体内解毒酶的活性,可能延长了毒力因子在体内存留时间及在体内的运输,使菌株发挥其毒效。二、单核细胞增生李斯特菌膜囊泡的制备及功能探究该研究部分以Lm野生菌株EGDe及其毒力突变株(EGDeΔprfA、EGDeΔprfA+pERL3-prfA*)为对象,利用超滤浓缩法和Optiprep密度梯度离心法提取Lm的MVs,并对两种方法提取的MVs的产率进行比较。通过测定不同MVs对菌株生物被膜的影响,以及不同MVs的溶血活性和对棉铃虫的感染毒性,探索其生物活性,以期为深入解析革兰氏阳性菌MVs的生理功能奠定基础,同时也为Lm致病机制的研究提供一些新的思路,现将以上研究结果报告如下:首先,通过上述两种方法提取了不同毒力Lm产生的膜囊泡(MVs):EGDe-MVs、ΔprfA-MVs以及prfA*-MVs。结果显示两种方法提取的Lm膜囊泡中EGDe-MVs的产率最高,ΔprfA-MVs次之,而prfA*-MVs的产率最低。另外,不同毒力的Lm均可向外分泌直径20-200 nm的MVs,且MVs的形态结构与菌株的毒力无明显关系。比较这两种方法,发现Optiprep密度梯度离心法提取的Lm-MVs的产率高、电镜观测效果好,但该方法操作相对复杂,耗时较长。相比之下,超滤浓缩法的提取效果虽然不及前者,但胜在其经济省时,同时考虑到实验室仪器设备有限,因此我们在本研究过程中主要采用超滤浓缩法提取。其次,将经过超滤浓缩法提取的MVs进行了 SDS-PAGE和银染,从而初步检测了 MVs的蛋白组成情况,与此同时我们还检测了不同Lm-MVs对细菌生物被膜形成的影响,比较了不同Lm-MVs的溶血活性和对棉铃虫幼虫的感染毒性,结果显示:(1)Lm-MVs不是仅含一种蛋白的单一组分,而是含有多种蛋白的复杂结构,且蛋白条带主要集中在50-70 kD。通过文献分析,其中58 kD和71 kD的蛋白分别可能为毒性蛋白李斯特菌溶血素LLO和内化素In1B;(2)MVs可以影响菌株生物被膜的形成,且具有一定的溶血活性,并能导致棉铃虫幼虫死亡或者降低其存活率和化蛹率,且其毒性与菌株本身毒性正相关。综上所述,我们认为棉铃虫幼虫(至少是4龄棉铃虫幼虫)适合作为研究Lm致病机制的宿主模型,且不同毒力的Lm能够诱发不同程度的免疫应答反应。由于Lm可致棉铃虫死亡,在此基础之上,我们考虑是否Lm分泌的MVs亦可能参与其致病进程,因此试图检测Lm-MVs的生物活性并尝试探讨其生物功能,发现不同毒力的Lm均可向外分泌直径20-200 nm的MVs,且MVs的形态结构与菌株的毒力无明显关系,但MVs可以影响菌株生物被膜的形成,同时它含有毒性蛋白组分,具有一定的溶血活性,并能导致棉铃虫幼虫死亡或者降低其存活率和化蛹率,且其毒性与菌株本身毒性正相关,这一定程度上验证了我们的猜想,由此我们初步认为Lm分泌的MVs极可能直接参与了 Lm对宿主的致病,并在细菌-细菌之间,以及细菌-宿主相互作用中扮演了重要角色。