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目的原位固化长效注射剂因其制备工艺简单、剂量准确、给药方便、释放缓慢且药物残体无需手术取出等优点,出现以来一直是缓释控释注射剂领域的研究热点,受到国内外的关注越来越多。其释药机理是将溶解于安全溶剂的高分子材料与药物混匀,皮下注射于给药部位,通过体内环境形成包裹药物的半固体或固体贮库。为此,应用原位固化技术制备抗寄生虫药物原位固化长效注射剂,如吡喹酮、氯硝柳胺等,这一设想不失为一个经济有效的控制包虫病和血吸虫病传播的良策。方法1.控制包虫病传染源的新型缓释制剂研究1.1吡喹酮原位固化长效注射剂的制备及处方筛选通过高效液相色谱法(HPLC)法建立了吡喹酮体外分析方法学,测定吡喹酮在多种分散介质的溶解度;根据释放度指标,单因素筛选了聚己内酯(PCL)和N-甲基-吡咯烷酮(NMP)作为吡喹酮(PZQ)原位固化长效注射剂的高分子材料和溶剂。使用Design-Expert.8.0的Box-Behnken设计三因素三水平三个中心点,通过首日释放度、释放时间作为筛选指标,对各影响因素进行分析,获得优选处方;通过不同处方在小鼠皮下释放情况,确定最优处方。1.2吡喹酮制剂的体内外研究通过高效液相-高分辨质谱联用技术(HPLC-HRMS)法建立吡喹酮对映体的体内外分析方法。通过HPLC-HRMS考察大鼠口服消旋吡喹酮(100mg/kg)、左旋吡喹酮(50mg/kg)和右旋吡喹酮(50mg/kg)混悬液后,吡喹酮对映体的代谢差异;考察消旋吡喹酮(1 g/kg)、左旋吡喹酮(1 g/kg)和右旋吡喹酮(1 g/kg)原位固化长效注射剂在体外的释放情况以及在小鼠体内的代谢差异;考察犬皮下注射消旋吡喹酮(100 mg/kg)原位固化长效注射剂后,吡喹酮对映体的代谢差异。1.3吡喹酮原位固化长效注射剂现场试验效果在甘孜州选择犬棘球绦虫感染阳性率较高的地区,将当地家犬随机分为对照组和给药组,给药组皮下注射100 mg/kg吡喹酮原位固化长效注射剂,对照组不给药。给药后1-6个月,每月采集犬粪检测犬粪抗原。比较对照组和给药组的犬粪阳性率,评估制剂疗效。2.控制血吸虫病传染源的新型缓释制剂研究2.1控制血吸虫病传染源的原位固化长效注射剂制备及处方筛选通过紫外可见分光光度法(UV)和高效液相色谱法(HPLC)法建立了氯硝柳胺体外分析方法学,通过紫外可见分光光度法(UV)建立了吡喹酮体外分析方法学;根据释放度指标,分别筛选了氯硝柳胺原位固化长效注射剂和吡喹酮原位固化长效注射剂的处方。2.2氯硝柳胺及吡喹酮原位固化长效注射剂抗小鼠日本血吸虫感染的药效在实验室中,65只小鼠随机分成13组,每组5只。25只小鼠按照450 mg/kg剂量1次皮下注射氯硝柳胺原位固化注射剂,15只小鼠按照450 mg/kg剂量1次皮下注射吡喹酮原位固化注射剂,对照组25只小鼠不给药。给药后1、15、43、57和71天后,每组各5只小鼠人工感染尾蚴80±4条。35天后,剖检感染小鼠,检获成虫,计算减虫率。2.3氯硝柳胺原位固化长效注射剂抗牛日本血吸虫感染现场试验在现场实验中,10头阴性牛分成两组,给药组4只牛按照30 mg/kg剂量1次皮下注射优选制剂,对照组6只牛不给药。分别于给药后的1月和3月筛查阳性牛,计算阳性率,考察制剂疗效。结果1.控制包虫病传染源的新型缓释制剂研究1.1吡喹酮原位固化长效注射剂的制备及处方筛选通过处方筛选,优选处方为“PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物):NMP:PZQ=1:3:2(w/v/w)”。根据PLGA处方制备的吡喹酮原位固化长效注射剂,小鼠皮下注射后,吡喹酮原位固化长效注射剂的剩余药量百分率由2 h的95.8%,降低至第130天的0.2%,在小鼠体内的释放时间为4个月左右。1.2吡喹酮制剂的体内外研究大鼠口服左旋吡喹酮和右旋吡喹酮对映体混悬液后,左旋吡喹酮(R-PZQ)和右旋吡喹酮(S-PZQ)体内具有代谢差异,其中R-PZQ的MRT比S-PZQ延长了 45.1%(p<0.01)。而S-PZQ的Cmax(最大血药浓度)和AUC(曲线下面积)比 R-PZQ 分别提高了 408.9%(p<0.01)和 212.9%(p<0.05)。吡喹酮原位固化长效注射剂在小鼠体内缓释4个月,在犬体内可以缓释6个月,S-PZQ的 AUC 和 Cmax 比 R-PZQ 分别显著提高了 79.2%(P<0.01)和 114.0%(P<0.05)。而R-PZQ的MRT(平均驻留时间)比S-PZQ显著提高了 96.3%(P<0.05)。即使 R-PZQ 的 T1/2(半衰期)比 S-PZQ 延长了 101.9%,S-PZQ的Ti/2与R-PZQ无显著性差异。1.3吡喹酮原位固化长效注射剂现场试验效果第一次在甘孜州道孚县协德乡,对照组给药后第四个月只有2.0%的阳性率,给药组1-6个月阳性率均为0.0%:第二次在甘孜州石渠县蒙宜乡,对照组和给药组的阳性率均为0.0%。给药组和对照组无显著性差异。2.控制血吸虫病传染源的新型缓释制剂研究2.1控制血吸虫病传染源的原位固化长效注射剂制备及处方筛选通过处方筛选,优选NCA处方为“PLGA:NMP:NCA:T80(吐温80)=1:6:0.3:1(w/v/w/w)”体外释放 3 个月,优选 PZQ 处方为“PLGA:NMP:PZQ=1:6:0.3(w/v/w)”体外释放2个月。2.2氯硝柳胺及吡喹酮原位固化长效注射剂抗小鼠日本血吸虫感染的药效氯硝柳胺原位固化注射剂在1、15、43、57和71天后,给药组虫数均显著少于对照组虫数(P<0.05),且减虫率均超过50.0%。吡喹酮原位固化长效注射剂在1和43天后,给药组的雌虫、雄虫和总虫数均显著少于对照组虫数(P<0.05),但15天时给药组的总虫数与对照组无显著性差异,减虫率只有15.1%。2.3氯硝柳胺原位固化长效注射剂抗牛日本血吸虫感染现场试验现场对照组牛1月和3月的阳性率分别为33.3%,50.0%,而给药组牛1月和3月的阳性率均为0.0%。结论1.通过处方筛选得到了缓释6个月的吡喹酮原位固化长效注射剂“PLGA:NMP:PZQ=1:3:2(w/v/w)”用于防治包虫病传染源;缓释3个月的氯硝柳胺原位固化长效注射剂处方“PLGA:NMP:NCA:T80=1:6:0.3:1(w/v/w/w)”用于防治血吸虫病。2.本研究制备的吡喹酮原位固化长效注射剂给药后R-PZQ和S-PZQ在犬体内的代谢明显存在对映体选择性。由于R-PZQ为具有抗虫疗效的对映体,我们推测本制剂中R-PZQ比S-PZQ释放时间更长,疗效也随之变长。究其原因可能是吡喹酮对映体对体内代谢酶的竞争性作用以及高分子高分子材料对手性药物的立体选择性等多重作用。用左旋吡喹酮的血药浓度对其疗效进行解释,不仅对于以后的制剂筛选更有参考意义,而且左旋吡喹酮的开发更符合WHO可持续发展的目标(SDGs)。3.抗犬棘球绦虫的现场实验中,对照组和给药组并无显著性差异。究其原因,“犬犬驱虫、月月投药”等包虫病防控政策实施以来,阳性犬数量可能急剧降低,导致试验的犬均可能为阴性,而试验期间对照组没有实施月月驱虫,所以可能再次感染棘球绦虫。为保证结果的可比性,下一步可以选择犬阳性率较高的现场,如西藏,再次进行试验。同时建立实验室犬感染棘球绦虫模型,使用吡喹酮原位固化长效注射剂进行试验。4.实验室药效试验中,吡喹酮原位固化长效注射剂对实验室小鼠抗日本血吸虫尾蚴感染时间达到1个月以上,氯硝柳胺原位固化长效注射剂对实验室小鼠抗日本血吸虫尾蚴感染时间达到2个月以上。现场实验中,对牛抗日本血吸虫尾蚴感染的保护达到3个月以上,具有应用现场、防治血吸虫感染的潜力。