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蛋鸡的骨骼是重要的免疫和钙储存器官,强壮的骨骼是蛋鸡健康和高生产的基础。负责吸收骨组织的破骨细胞和沉积骨组织的成骨细胞共同维持蛋鸡骨代谢平衡。代谢失衡导致蛋鸡的骨骼疾病,如骨质疏松症,严重影响蛋鸡生产。免疫系统和骨骼系统密切相关,他们之间存在许多共有的细胞和细胞因子,如Treg细胞、IL-1、IL-10等,作用于RANKL/OPG、RUNX2和WNT信号通路调节骨代谢,维护骨稳态。而肠道菌群一方面通过改变短链脂肪酸水平等方式直接参与调节骨骼代谢,另一方面肠道菌群和免疫密切联系,通过调节机体免疫功能影响骨代谢,是解决蛋鸡骨骼问题的潜在靶点。丁酸梭菌是一种产生丁酸盐的肠道共生菌,因其维持肠道菌群稳态并积极调节免疫功能,被作为益生菌广泛应用于肉禽养殖业。有关丁酸梭菌在蛋鸡养殖中应用的研究较少,且尚未有人探索丁酸梭菌对蛋鸡骨骼的影响及作用机制。因此本研究在此基础上开展了丁酸梭菌对蛋鸡骨骼和免疫功能的影响与机制研究。1.丁酸梭菌对育雏期、产蛋初期、产蛋高峰期和产蛋后期蛋鸡骨骼和生产性能的影响能对蛋鸡的生产产生积极促进作用是一切研究的基础。通过将丁酸梭菌添加进蛋鸡养殖饲料中,研究丁酸梭菌添加对蛋鸡发育和生产性能的影响。研究结果显示,丁酸梭菌对育雏期蛋鸡体重的作用不显著,但从饲喂的第21天开始降低育雏期蛋鸡的采食量（P＞0.05）,1×10~9 CFU/kg丁酸梭菌处理在试验的第5周时增加胫宽（P＜0.05）,丁酸梭菌和丁酸盐处理均显著增加育雏期蛋鸡胫骨和股骨的骨骼指数（P＜0.05）。对于产蛋初期蛋鸡,1×10~7 CFU/kg丁酸梭菌处理降低产蛋初期蛋鸡的产蛋率（P＜0.05）,但1×10~8CFU/kg丁酸梭菌处理增加产蛋率（P＜0.05）,两种梯度丁酸梭菌处理均增加产蛋初期蛋鸡的平均蛋重（P＜0.05）,1×10~8 CFU/kg丁酸梭菌处理增加胫骨指数（P＞0.05）,但降低胫骨抗弯强度（P＜0.05）。对于产蛋高峰期蛋鸡,1×10~8 CFU/kg丁酸梭菌处理略微增加产蛋率（P＞0.05）,显著提高蛋壳重量和平均蛋重（P＜0.05）,但试验的第6、8周降低了蛋壳指数和蛋壳强度（P＜0.05）,对胫骨抗弯强度无显著影响（P＞0.05）,一定程度上增加了股骨的抗弯强度（P＞0.05）,提高血清中钙（P＞0.05）、磷水平（P＜0.05）。丁酸梭菌处理对产蛋后期蛋鸡作用不显著（P＞0.05）,略微增加产蛋率和蛋壳指数（P＞0.05）。综上研究表明,饲料中添加丁酸梭菌有利于改善蛋鸡产蛋率、平均蛋重和蛋壳质量,并在蛋鸡育雏阶段显著促进胫骨发育。2.丁酸梭菌对蛋鸡肠道菌群的调控作用肠道菌群大致可分为益生菌、中性菌和有害菌,本研究将从这三方面研究丁酸梭菌对肠道菌群的调控作用。研究结果发现,丁酸梭菌和丁酸盐处理可提高肠道菌群的丰富度和遗传多样性,显著增加肠道中两种产短链脂肪酸属Faecalibacterium和Subdoligranulum的相对丰度,上调盲肠内容物中乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸和正戊酸含量。丁酸梭菌和丁酸盐处理均增加肠道菌群种水平中产丁酸细菌的丰度,其中丁酸梭菌处理主要增加Subdoligranulum＿variabile相对丰度,而丁酸盐处理增加Faecalibacterium＿prausnitzii的相对丰度。选用肠炎沙门菌作为代表性肠道有害菌,研究结果发现,丁酸梭菌预处理可降低1×10~6CFU沙门菌感染6天后肝脏（P＜0.05）和脾脏（P＞0.05）中的沙门菌载量。综上结果表明,丁酸梭菌可积极调节蛋鸡肠道菌群,提高菌群丰富度和遗传多样性,提高有益菌丰度,上调肠道中短链脂肪酸含量,并可有效抵御肠炎沙门菌的侵袭。3.丁酸梭菌对蛋鸡骨骼的影响及机理研究本研究通过检测丁酸梭菌对蛋鸡骨骼发育、钙磷含量、结构及骨细胞代谢的影响,探明丁酸梭菌促进蛋鸡骨骼发育的作用机理。研究结果发现,丁酸梭菌和丁酸盐处理对蛋鸡体重影响不明显（P＞0.05）,灌服丁酸梭菌显著提高了蛋鸡的胫骨指数、胫骨灰分和胫骨钙含量（P＜0.05）,显著降低了血清中磷含量（P＜0.05）,而丁酸盐处理只增加了胫骨灰分（P＜0.05）。丁酸梭菌和丁酸盐处理均未显著影响胫骨和股骨的抗弯强度（P＞0.05）。进一步分析发现,丁酸梭菌处理主要增加了胫骨两端的骨密度（P＜0.05）,并增加胫骨上端骨小梁的数量和厚度。丁酸梭菌处理组血清成骨标志物ALP的含量显著提高（P＜0.05）,胫骨组织切片ALP和TRAP染色结果显示,丁酸梭菌和丁酸盐处理可增强成骨细胞活性,降低破骨细胞数量。丁酸梭菌可显著上调盲肠和股骨中BMP2,胫骨中RUNX2的相对表达（P＜0.05）,并下调各组织中RANKL/OPG比值。综上研究结果表明,丁酸梭菌处理可上调蛋鸡BMP2、RUNX2表达,并降低RANKL/OPG比值,提高成骨细胞活性和降低破骨细胞骨数量,增加胫骨钙含量和胫骨两端的骨密度,促进蛋鸡骨骼发育。4.丁酸梭菌对蛋鸡免疫和成骨细胞功能的影响及作用机制本研究从检测丁酸梭菌体内对免疫系统细胞因子表达和淋巴细胞亚群比例变化的影响,丁酸梭菌培养上清（CBCS）体外对淋巴细胞分化和细胞因子表达的影响,CBCS处理淋巴细胞后的培养物上清对成骨细胞的骨形成和细胞因子表达的影响,三个方面综合分析丁酸梭菌对蛋鸡骨骼和免疫的作用机理。试验结果表明,丁酸梭菌可以促进脾脏发育,并显著提高脾脏IL-2、IL-10,盲肠IL-10、NF-κB,胫骨IL-10及体外培养的淋巴细胞IL-1、IL-10的相对表达（P＜0.05）。丁酸梭菌处理还显著上调脾脏中CD4+,脾脏及外周血中CD4+CD25+（Tregs）和体外培养淋巴细胞中CD8+、CD4+CD25+T细胞的比例（P＜0.05）。CBCS还上调淋巴细胞中P-JNK/JNK及P-P38/P38比值（P＜0.05）,体外丁酸盐对照组（SASB）上调P-ERK/ERK（P＜0.05）比值。通过对成骨细胞茜素红染色和ALP活性检测,单独使用CBCS和SASB对成骨细胞矿物结节形成能力无显著影响（P＞0.05）,而淋巴细胞培养产物,特别是CBCS和SASB处理过的淋巴细胞产物具有显著的成骨细胞诱导活性,并显著上调成骨细胞中OPG、BMP2、RUNX2和Wnt3a,下调RANKL和Wnt5a的相对表达（P＜0.05）。结果表明,丁酸梭菌可在体外激活淋巴细胞中MAPK信号通路,提高体内Tregs比例和IL-10表达,并在淋巴细胞介导下,调节BMP2/RUNX2、RANKL/OPG和WNT通路,促进成骨细胞成骨作用。综上所述,丁酸梭菌可正向调节蛋鸡肠道微生物群和免疫功能并有益于骨发育。