家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目昆虫遗传与分子生物学研究的模式昆虫之一，也是一种重要的经济昆虫。经过长期的研究，家蚕积累了大量的遗传育种、生理生化、分子生物学和基因组学等方面的研究基础。对家蚕变态发育激素调控的研究，不仅有助于阐明家蚕变态发育的分子调控机理，促进人们对昆虫变态发育分子和遗传基础的认识，更重要的是能为家蚕发育的人为调节和害虫的生物防治提供新的思路。　　昆虫蜕皮变态受到蜕皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(Juvenile hormone，JH)的协同调控。蜕皮激素与受体EcR/USP异源二聚体结合后，诱导了初级应答转录因子如BR-C(Broad Complex)、E75、E74和E93等基因的表达，而初级转录因子进一步调节下游次级应答因子如βFTZ-F1、HR3、HR4、HR39和E78等基因的表达，这些次级应答因子再调控了与蜕皮和变态发育直接相关的靶基因，如表皮蛋白、几丁质合成酶、多巴胺脱羧酶和多酚氧化酶等基因的表达，最终导致变态的发生。表皮蛋白基因在昆虫激素的作用下在特定时期表达，合成了表皮蛋白，与几丁质纤维丝组成了昆虫的表皮。目前的研究尚不能很好地阐述表皮蛋白基因表达的激素调控机制。本文对家蚕蛹期专一表达的翅原基表皮蛋白(wing dics cuticle protein，WCP)基因BmWCP4的转录调控机制进行了深入系统的研究，并对该基因在蚕业生产上的应用进行了初步探讨。获得的主要结果如下：　　(1)家蚕翅原基表皮蛋白基因BmWCP4全长cDNA为1081bp，基因长为1545bp，由4个外显子和3个内含子组成，在基因组中以单拷贝的形式存在，对其结构进行分析发现，该蛋白的N端包含一个10个氨基酸组成的信号肽(MFSKIVLICA)和3个能增强与几丁质结合能力的短序列(AAPV)，C端包含与几丁质结合的结构域。这些分析暗示了，翅原基表皮蛋白基因BmWCP4具备结合几丁质的能力；　　(2)为明确BmWCP4的表达情况，进行了Northern blot、RT-PCR和Western blot分析。结果显示，BmWCP4仅在化蛹时和蛹中期表达，在幼虫期检测不到其表达，且只在表皮组织表达，在脂肪体和中肠组织未检测到其表达，同时BmWCP4的表达趋势与家蚕体内20E含量的变化一致。这些结果表明BmWCP4是一个在蛹期专一表达的基因，且其表达可能受到20E的调控；　　(3)为明确BmWCP4与昆虫激素的关系，进行了离体表皮和体内激素处理实验，结果表明BmWCP4的表达受20E诱导，JHⅢ可抑制20E的诱导作用；　　(4)为分析BmWCP4基因的转录调控机制，通过Tail PCR的方法克隆了其启动子区域，预测分析的结果显示，启动子区域中包含E-box、fork head、BR-C、βFTZ-F1、E74及POU等转录结合位点。启动子缺失实验表明，在-987nt至-872nt和-337m至-94nt的启动子区域中分别存在响应蜕皮激素的反应元件。EMSA的结果显示，细胞中存在着转录因子与βFTZ-F1反应元件结合，核转录因子BmPOUM2与POU反应元件特异性结合。这些结果表明，转录因子BmβFTZ-F1和BmPOUM2通过响应20E的作用，激活了BmWCP4的表达；　　(5)对BmPOUM2基因进行了克隆，发现其在基因组中以单拷贝的形式存在，但转录出长和短2种mRNA可变剪切形式(BmPOUM2-L和BmPOUM2-S)，短的剪切形式与长的相比，缺失了115个氨基酸的片段，其中包含与DNA结合的结构域(homeodomain)和细胞核定位信号肽，这暗示了两种BmPOUM2的mRNA可变剪切体在调控BmWCP4表达的功能中可能起着不同的作用，在家蚕的变态发育过程中扮演着不同的角色；　　(6)为明确BmPOUM2的两种mRNA可变剪切体各自的功能，对这两个剪切体的表达情况、亚细胞定位及与BmWCP4启动子上POU反应元件的结合情况进行了分析，长的mRNA剪切形式BmPOUM2-L主要在预蛹期和蛹中期高水平表达、响应20E的诱导作用、定位在细胞核中并与POU反应元件特异结合；而短的mRNA剪切形式BmPOUM2-S主要在幼虫期和成虫期高水平表达、不能响应20E诱导作用、定位在细胞质中且不能与POU反应元件结合。这些结果暗示长的mRNA剪切形式BmPOUM2-L是BmWCP4蛹期专一表达所必须的，调控着BmWCP4的蛹期专一性的表达；而短的剪切形式BmPOUM2-S不具备转录因子的功能，不直接参与调控BmWCP4的表达；　　(7)为研究BmPOUM2-L是否调控BmWCP4的蛹期专一性表达及其在家蚕变态发育过程中所起的作用，对熟蚕期第1天的家蚕进行了BmPOUM2-LdsRNA的处理，家蚕体内BmPOUM2-L基因的表达受到抑制的同时，BmWCP4的表达也受到抑制，同时其他的翅原基表皮蛋白基因(BmWCP1、BmWCP2、BmWCP3、BmWCP5、BmWCP6、BmWCP8和WCP9)、多巴胺脱羧酶基因Dopamine decarboxylase(DDC)及丝胶蛋白基因sericin-1在mRNA水平的表达也受到抑制，这表明BmPOUM2-L参与了与化蛹相关的许多基因的表达调控作用；　　(8)对熟蚕期第1天的家蚕进行BmPOUM2-L的RNA干扰，导致家蚕翅原基在化蛹期的生长分化受到抑制、胸节表皮呈现透明且幼虫不能进行吐丝结茧，最终导致家蚕不能完成幼虫向蛹的变态发育过程，这表明BmPOUM2-L通过调控一系列翅原基表皮蛋白基因(BmWCPs)和其它变态发育相关基因的表达，促进了翅原基的分化发育，实现了幼虫-蛹的转变过程，在家蚕变态发育过程中起着非常关键的作用；　　(9)为进一步验证BmPOUM2-L对BmWCPs的调控作用，在BmN细胞中超表达BmPOUM2-L蛋白，可激活BmWCP3-BmWCP8的启动子对报告基因的调控作用，这表明BmPOUM2-L对BmWCP3-BmWCP8等其它翅原基表皮蛋白基因的表达都具有调控作用；　　(10)为研究20E是直接还是间接对BmPOUM2起调控作用，对蛹期专一的BmBR-CZs的表达情况和激素诱导的表达情况进行分析，发现BmBR-CZ4可能参与对BmPOUM2表达的调控。在BmN细胞中超表达BmBR-CZ4蛋白，可提高BmPOUM2-L在mRNA和蛋白水平表达量的增加，从而提高BmWCP4启动子在BmN细胞中的活性，这表明转录因子BmBR-CZ4是调控BmPOUM2表达的上游因子；　　(11)为鉴定出与BmPOUM2相互作用的蛋白，以BmPOUM2-L为诱饵蛋白，进行了His-tagpull-down和Far-western Blot实验，鉴定出了一个与BmPOUM2-L蛋白相互作用的蛋白因子，Hox家族的BmAbdominal-A(BmAbd-A)。以BmAbd-A蛋白为诱饵蛋白，翅原基中的核蛋白为目的蛋白，His-tagpull-down得到的蛋白条带能识别BmPOUM2抗体。EMSA的结果显示，重组表达的BmPOUM2-L和BmAbd-A蛋白在体外孵育后，通过BmPOUM2-L结合到BmWCP4调控区域的POU反应元件上。这些结果表明BmPOUM2-L和BmAbd-A蛋白形成复合物，通过BmPOUM2-L结合到POU反应元件上参与了BmWCP4表达的调控；　　(12)为进一步研究BmAbd-A的情况，对其表达情况进行分析，RT-PCR的结果显示，BmAbd-A在胸节表皮中主要在熟蚕期和蛹中期表达，并能响应20E的诱导，BmAbd-A的表达情况与BmPOUM2-L和BmWCP4的表达趋势一致，这表明BmAbd-A可能参与了BmPOUM2-L对BmWCP4的调控。　　(13)为检测BmAbd-A和BmPOUM2蛋白在家蚕体内是否相互作用，对BmAbd-A、BmPOUM2和BmWCP4这三个蛋白进行免疫荧光细胞共定位，结果显示，在预蛹期的翅原基中，BmAbd-A和BmPOUM2蛋白定位在翅原基同一细胞的细胞核且围绕着核膜，而BmWCP4蛋白定位在细胞质中，这表明在家蚕体内，转录因子BmAbd-A和BmPOUM2相互作用协同参与了对BmWCP4表达的调控。　　(14)构建了用于转基因家蚕的pBac[WCP4P-GAL4-hsp70term，3xP3-EGFPafm]、pBac[UAS-GRIM-SV40-3xP3DsRedaf]和pBac[UAS-CIDE-B-SV40-3xP3DsRedaf]转基因表达载体，为利用BmWCP4启动子获得蛹期发育延迟的家蚕品系奠定了基础。　　归纳以上结果，我们得到昆虫激素调控家蚕化蛹变态发育的模型：20E与其受体异型二聚体复合物结合，首先启动BmβFTZ-F1和BmBR-CZ4等转录因子的表达。BmβFTZ-F1结合到βFTZ-F1调控元件上，而BmBR-CZ4激活转录因子BmPOUM2的表达，BmPOUM2基因表达并产生BmPOUM2-L，后者进入细胞核中与BmAbd-A相互作用形成复合物，通过BmPOUM2-L结合到BmWCP4基因的POU调控元件上，从而启动BmWCP4的表达，同时BmPOUM2-L也直接或间接的调控了其它翅原基表皮蛋白基因(BmWCP1、BmWCP2、BmWCP3、BmWCP5、WCP6、BmWCP8和WCP9)表达，从而促进了翅原基的分化发育，并最终使得幼虫实现向蛹期的变态发育。　　本论文主要突破在于详细地分析了家蚕表皮蛹期专一表达的翅膀原基表皮蛋白BmWCP4基因在蜕皮激素的作用下的表达与调控，首次实验证明核转录因子BmBR-CZ4和BmPOUM2参与了昆虫变态发育的调控过程，发现核转录因子BmAbd-A能与BmPOUM2-L结合，调控了变态发育相关的BmWCP4表达，并提出BmBR-CZ4对BmPOUM2的调控、BmPOUM2-L蛋白及BmPOUM2与BmAbd-A相互作用等因素是导致BmWCP4在蛹期的专一性表达的重要原因。这些工作为利用BmWCP4启动子的调节机理，构建转基因家蚕，实现对家蚕蛹期发育的调控奠定了重要的理论基础，也解释了蜕皮激素对BmWCP4表达的调控机理，同时也为进一步阐明昆虫激素对与蜕皮变态相关的其它基因的调控作用提供了线索。