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绒毛膜癌简称绒癌(Choriocarcinoma),是一类滋养细胞的恶性肿瘤。近些年,化疗药物的应用极大提高了患者的存活率,但由于传统化疗药物严重的毒副作用限制了药物疗效和临床应用。二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY)是提取自葡萄科植物藤茶的一种黄酮类化合物,已有学者报道DMY能够抑制胃癌、肝癌、结肠癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌等肿瘤细胞的生长。但在绒癌中的作用尚未有文献报道。本研究以人绒癌JAR细胞为研究对象,旨在说明DMY联合VP16对绒癌JAR细胞增殖和凋亡的影响,并初步探索DMY联合VP16通过抑制JAR细胞中NF-κB的核转位过程而发挥作用。为DMY联合VP16在绒癌中的临床治疗提供理论依据。第一部分二氢杨梅素联合依托泊苷对绒癌JAR细胞抑制作用的研究目的:探讨二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY)联合依托泊苷(etoposide,VP16)对绒癌JAR细胞的抑制作用及其相关的机制。方法:1.利用噻唑蓝(MTT)法检测空白对照组、DMY组、VP16组以及DMY与VP16联合组(DMY+VP16)各自绒癌JAR细胞增殖情况。2.利用台盼蓝拒染实验观察空白对照组、DMY组、VP16组以及DMY与VP16联合组(DMY+VP16)中被蓝染的死亡JAR细胞的数量和形态。3.利用流式细胞术Annexin-FITC/PI双染检测分析空白对照组、DMY组、VP16组以及DMY与VP16联合组(DMY+VP16)绒癌JAR细胞的凋亡率4.以正常肝脏HL7702细胞作为绒癌JAR细胞的正常对照细胞株,两株细胞同时设空白对照组、DMY组、VP16组以及DMY与VP16联合组(DMY+VP16),利用克隆形成实验检测各组细胞生存能力,观察药物的毒性作用。5.利用蛋白免疫印迹(Western Blotting)法检测空白对照组、DMY组、VP16组以及DMY与VP16联合组(DMY+VP16)绒癌JAR细胞中凋亡抑制蛋白BCL-2、c-IAP-2表达水平。结果:1.噻唑蓝(MTT)检测结果显示,与空白对照组比较,DMY组、VP16组及DMY+VP16组在24h和48h时间点的绒癌JAR细胞存活率均下降,且DMY+VP16组绒癌JAR细胞存活率下降最为明显。2.台盼蓝拒染实验可见空白对照组绒癌JAR细胞形态正常,细胞数最高,视野中未见到蓝染细胞;DMY组细胞数减少,视野中可见少量蓝染细胞;VP16组细胞数减少,细胞变形,视野中可见少量蓝染细胞;联合用药组细胞数显著减少,细胞形态明显异常,视野中可见了大量蓝染细胞。3.Annexin-FITC/PI双染流式细胞术结果显示,与对照组相比各实验组JAR细胞凋亡率均有增高,DMY+VP16组JAR细胞凋亡率明显高于各单独用药组。4.克隆形成实验结果显示,对于JAR细胞,实验组的克隆球数目均少于对照组,且DMY+VP16组克隆球数目最少;对于正常肝脏HL7702细胞,DMY组与对照组相比无明显差异,VP16组与DMY+VP16组相比亦无明显差异。5.Western Blotting实验结果显示,与对照组相比,无论DMY还是VP16均可下调绒癌JAR细胞中BCL-2、c-IAP-2蛋白表达,且DMY+VP16组下调作用最明显。结论:二氢杨梅素联合依托泊苷明显增强对绒癌JAR细胞的生长抑制作用,联合使用可以减少化疗药物VP16的用量,其抑制绒癌JAR细胞作用可能与下调BCL-2、c-IAP-2蛋白的表达有关。第二部分二氢杨梅素在绒癌JAR细胞中NF-κB通路的调节作用的研究目的:为探明DMY单独及联合VP16使用对绒癌JAR细胞中NF-κB通路是否存在调节作用。方法:1.利用蛋白免疫印迹(Western Blotting)法确定TNF-α的最适作用时间并研究DMY对TNF-α诱导不同时间下JAR细胞中p-ⅠκBα表达的影响。2.利用蛋白免疫印迹法检测不同浓度DMY对JAR细胞内p-ⅠκBα、ⅠκBα、NF-κB以及核转位NF-κB的影响。3.利用蛋白免疫印迹法检测分析DMY与VP16联合使用对JAR细胞内p-ⅠκBα、ⅠκBα、NF-κB以及核转位NF-κB的影响。结果:1.随着TNF-α作用时间的延长,JAR细胞中ⅠκBα表达量逐渐减少;而p-ⅠκBα的表达量先升高后降低,且TNF-α作用10min时,细胞内p-ⅠκBα表达量最高;此外,实验组(加DMY)细胞p-ⅠκBα表达量明显低于对照组(不加DMY)。2.随着DMY作用浓度增高,JAR细胞中ⅠκBα表达逐渐增加;而胞内磷酸化形式p-ⅠκB表达量逐渐减少;胞内NF-κB表达总量逐渐减少;发生核转位的NF-κB也逐渐减少。3.DMY与VP16联合作用的Western blotting结果可见,就ⅠκBα表达量而言,与对照组相比,各用药组JAR细胞中ⅠκBα表达量均有减少,且联合组ⅠκBα表达量降低最明显;就胞内p-ⅠκBα表达量而言,与对照组相比,各用药组p-ⅠκBα表达量都有所减少,且联合组p-ⅠκBα表达量明显少于DMY组,但联合组与VP16组相比,联合组p-ⅠκBα表达量高于VP16组;就胞内NF-κB表达总量以及核内NF-κB的量而言,与对照组相比,各用药组均有减少,且联合组降低最明显。结论:1.TNF-α最适作用时间为10min时,此时,JAR细胞内磷酸活化形式的p-ⅠκBα表达量最高;2.DMY可以抑制各个TNF-α作用时间点细胞内p-ⅠκBα表达量,且差异具有统计学意义;3.DMY可能同时通过减少NF-κB的表达量和抑制ⅠκBα的磷酸化,来抑制NF-κB的核转位过程;4.DMY与VP16联合使用时通过协同减少NF-κB的表达量来减少转位入核的NF-κB量。