以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术迅速发展,已经在动物模型的构建、药物靶点的筛选和基因治疗等领域发挥了重要作用。目前CRISPR/Cas9的靶向范围和特异性都得到了广泛的优化,开发出多种靶向范围更广和特异性更高的Cas9突变体。但是关于提升CRISPR/Cas9在细胞内基因编辑效率的研究相对较少,已有的研究主要集中在优化Cas9密码子和核定位信号,以及增强细胞内染色质的开放性提高基因编辑效率。因此本研究希望通过增强Cas9的DNA结合能力来开发提高基因编辑效率的增强型基因编辑工具。首先,我们筛选了11种非序列特异性的DNA双链结合蛋白,发现Cas9与来源于果蝇的HMG-D蛋白融合后基因编辑效率最高。通过优化蛋白间的linker长度、HMG-D蛋白融合的位置和数量,我们获得了高度增强基因编辑效率的Cas9变体（He E-Sp Cas9）。接着,我们在多个内源性靶点中测试He E-Sp Cas9的基因编辑效率,通过高通量测序分析发现He E-Sp Cas9在41个内源性靶点上基因编辑效率平均提高了1.4倍。为了拓展He E-Sp Cas9在基因组上的靶向范围,我们通过融合HMG-D蛋白开发出靶向“NGN”PAM和几乎没有PAM限制的增强型Sp Cas9突变体,在多个内源性靶点上基因编辑效率都提高了1.3倍以上。同时我们也通过融合HMG-D蛋白分别开发出增强型转录激活工具（d He E-Sp Cas9-VPR）和增强型碱基编辑器（He E-BE4max和He E-ABEmax）,分别可以提高多个内源靶点的转录激活效率和碱基转换效率。为了评估增强型基因编辑工具的保真性,我们通过高通量测序分别在预测的脱靶位点和文献报道的脱靶位点上检测脱靶效率,结果表明,增强型基因编辑工具在不发生脱靶的位点上同样不会产生脱靶。通过递送RNP或hp-sg RNA可以明显降低脱靶效率,提高增强型基因编辑工具的特异性。最重要的是通过PEMseq全基因组脱靶分析,我们发现He E-Sp Cas9没有明显增加细胞内脱靶位点的数量。最后,我们利用AAV8递送He E-Sp Cas9/sg RNA到成年小鼠的肝脏中,成功实现Pcsk9基因的高效编辑,基因编辑效率提高了1.7倍以上,明显降低了小鼠血液胆固醇含量。综上所述,我们通过融合HMG-D蛋白增强DNA结合能力开发出多种增强型基因编辑工具,并且成功在成年小鼠肝脏中实现了高效的基因编辑,为疾病的基因治疗提供了概念性验证。