[研究背景]肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是由脊髓、脑干运动神经元进行性变性所致的慢性神经退行性疾病。临床表现为进行性全身肌肉无力、萎缩,最终导致瘫痪甚至死亡。研究发现,家族性ALS病例中,20%的患者与铜锌超氧化物岐化酶1(Cu Zn superoxide dismutase, SOD1)基因突变有关,突变的类型超过125种,但病人的症状都相似,推测运动神经元的变性是一种或多种因素共同作用的结果。表达突变人类SOD1的转基因小鼠能够再现ALS的症状,而表达相同拷贝的野生型人类SOD1的小鼠却没有出现疾病的症状。SOD1G93A转基因小鼠是目前研究ALS发病机制的可靠动物模型。研究发现,ALS发病与生长因子缺乏、线粒体异常、轴突异常、氧化应激、炎症、兴奋性毒性、蛋白折叠等有关,但是选择性运动神经元的退化机制仍不明确,尚无有效地治疗方法。经典Wnt/p-catenin信号通路是由多种蛋白质组成并相互作用的复杂网络,在多种细胞的增殖、分化、运动及形态发生中发挥重要作用。研究发现,Wnt信号通路异常与多种神经退行性疾病相关,如阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)、帕金森病(Parkinson’s disease, PD)、亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease, HD)等。但是,Wnt信号通路在ALS发病过程中的作用尚不清楚。基于上述分析,我们设计了本实验。本实验采用SOD1G93A转基因小鼠动物模型、原代培养的SOD1G93A转基因鼠星形胶质细胞模型和SOD1突变型神经细胞模型(N2a神经细胞模型),应用免疫荧光技术、激光共聚焦显微镜技术、RT-PCR、Western blot、细胞培养等形态学和分子生物学方法,体内与体外实验相结合,从细胞、蛋白、基因等不同水平综合检测了Wnt/p-catenin信号通路中关键信号分子的表达变化,研究了Wnt/p-catenin信号通路与ALS发病的关系,揭示了Wnt/p-catenin信号通路在ALS脊髓发病中的作用及机制,以期寻找治疗ALS的新靶点,为防治ALS的发生提供新的实验依据。[研究方法]1.选择ALS转基因小鼠60只,随机分为三组,分别于发病早期、中期和晚期不同阶段(95d,108d,122d)处死动物、分离脊髓,部分标本提取总RNA并反转录成cDNA,应用RT-PCR方法检测Wnt/p-catenin信号通路关键信号分子Wnt配体(包括Wnt3a、Wnt2和Wnt7a)、GSK-3β、β-catenin和Cyclin D1在ALS转基因鼠脊髓mRNA水平的表达变化。部分标本提取总蛋白或核蛋白,应用Western blot方法检测关键信号分子蛋白水平的表达变化。部分动物在ALS转基因鼠发病初期(90d)腹腔注射BrdU(50mg/kg体重,每天1次,连续5天),在最后一次注射BrdU后1、14、28d(即95d,108d,122d)用4%的多聚甲醛行心脏灌注固定,分离出脊髓,制备冰冻切片,应用免疫组织化学染色、免疫荧光双标以及多标染色技术检测关键信号分子在ALS转基因鼠脊髓中的表达规律以及与细胞增殖、分化的相关关系。每组均选择同窝出生的野生型鼠做为对照组。2.取出生第3d的ALS新生鼠,无菌条件下取出脊髓,胰蛋白酶消化,体外培养、纯化原代星形胶质细胞,以培养同窝出生的野生型鼠脊髓星形胶质细胞作为对照组。应用Western blot和免疫荧光双标染色方法检测ALS鼠和野生型鼠原代培养星形胶质细胞中Wnt/p-catenin信号通路关键信号分子Wnt3a、 β-catenin和Cyclin D1的表达变化。3.选取小鼠成神经瘤细胞系N2a,分别转染pEGFP-WT-SODl和pEGFP-G93A-SOD1质粒,制备野生型和SOD1突变型神经细胞模型。部分细胞于转染后24h和48h提取蛋白,部分细胞用于制备细胞爬片。应用Western blot和免疫荧光染色方法检测ALS细胞模型中Wnt/β-catenin信号通路关键信号分子Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1的表达变化。[结果]1. Wnt/β-catenin信号通路关键信号分子在ALS转基因鼠脊髓中的表达变化(1)Wnt3a、Wnt2和Wnt7a配体在ALS转基因鼠脊髓中的表达变化：与同窝出生的野生型鼠相比,ALS转基因鼠脊髓中Wnt3a、Wnt2和Wnt7a三种配体mRNA、蛋白表达均上调,差异均有统计学意义p<0.05,p<0.01)。免疫组织化学结果显示,ALS转基因鼠脊髓中Wnt3a、Wnt2和Wnt7a阳性细胞主要分布在脊髓前角,即神经退行性病变发生的部位。95d、108d、122d,ALS转基因鼠脊髓中Wnt3a、Wnt2和Wnt7a免疫反应强于同一时间点的野生型鼠。免疫荧光双标结果显示,ALS转基因鼠脊髓中,95d、108d、122d,Wnt3a、Wnt2和Wnt7a在GFAP标记的星形胶质细胞中表达均增加,以122d最显著(P<0.05,P<0.01)。108d和122d,Wnt3a在β-tubulinⅢ标记的脊髓前角神经元中表达降低p<0.05)。以Wnt3a为例检测了Wnt配体在BrdU标记的增殖细胞中的表达情况,结果显示,ALS鼠和野生型鼠均未检测到BrdU+/Wnt3a+双阳性细胞。(2) GSK-3β在ALS转基因鼠脊髓中的表达变化：ALS鼠与同窝野生型鼠相比,GSK-3β mRNA和总蛋白在95d、108d、122d表达均无明显变化,差异均无统计学意义,p-GSK-3β(Ser9)蛋白在95d、108d、122d表达均上调,差异均有统计学意义p<0.05,p<0.01)。免疫组织化学染色结果显示,p-GSK-3β(Ser9)免疫阳性细胞主要集中分布在脊髓灰质前角。95d、108d、122d,ALS转基因鼠脊髓中p-GSK-3β(Ser9)免疫阳性反应均强于同一时间点的野生型鼠。免疫荧光双标染色结果显示,GSK-3β特异性表达在β-tubulinⅢ标记的神经元,在BrdU标记的增殖细胞和GFAP标记的星形胶质细胞中均无表达。(3) β-catenin在ALS转基因鼠脊髓中的表达变化：与同窝出生的野生型鼠相比,ALS鼠脊髓中β-catenin mRNA和总蛋白在95d、108d、122d表达均无明显变化,差异均无统计学意义。95d,核内β-catenin蛋白无明显变化,108d、122d核内β-catenin蛋白表达均上调,差异均有统计学意义p<0.05)。免疫荧光结果显示,108d、122d,与同窝野生型鼠相比,ALS转基因鼠脊髓灰质中表达在细胞核的β-catenin阳性细胞增多,表达在细胞膜的β-catenin阳性细胞减少。免疫荧光双标结果显示,108d、122d,与同窝野生型鼠相比,ALS转基因鼠脊髓中β-catenin+/GFAP+双阳性细胞均增多p<0.05,p<0.01),β-catenin+/β-tubulinⅢ+双阳性细胞均减少p<0.05)。95d、108d、122d,野生型鼠和ALS转基因鼠脊髓中均未检测到BrdU+/β-catenin+双阳性细胞。(4) Cyclin D1在ALS转基因鼠脊髓中的表达变化：与同窝出生的野生型鼠相比,ALS转基因鼠脊髓中Cyclin D1mRNA、蛋白表达均上调,差异均有统计学意义p<0.05,p<0.01)。免疫荧光结果显示,95d、108d、122d,与同窝出生的野生型鼠相比,ALS转基因鼠脊髓灰质、白质和中央管Cyclin D1阳性细胞均增多。免疫荧光双标染色结果显示,95d, ALS转基因鼠脊髓中BrdU+/Cyclin D1+双阳性细胞较野生型鼠增多,差异有统计学意义p<0.05)。Cyclin Dl+/β-tubulinⅢ+和Cyclin D1+/GFAP+双阳性细胞主要分布在脊髓灰质前角。108d、122d,与野生型鼠相比,ALS鼠脊髓灰质前角Cyclin D1+/(3-tubulinⅢ+双阳性细胞和Cyclin D1+/GFAP+双阳性细胞均增多(p<0.05),以122d Cyclin D1+/GFAP+双阳性细胞增多更明显(p<0.01)。为了检测增生细胞的分化方向,我们做了免疫荧光三标实验,结果显示,在ALS转基因鼠脊髓白质中可检测到BrdU+/Cyclin D1+/GFAP+三阳性细胞,未见BrdU+/Cyclin D1+/β-tubulinⅢ+三阳性细胞,表明增殖细胞主要向星形胶质细胞分化。2. Wnt/β-catenin信号通路关键信号分子在原代培养ALS转基因鼠脊髓星形胶质细胞中的表达变化(1) Wnt3a在原代培养ALS新生鼠脊髓星形胶质细胞中的表达变化：Western blot结果显示,与野生型新生鼠比较,ALS转基因新生鼠原代培养的脊髓星形胶质细胞中Wnt3a蛋白表达上调,差异有统计学意义(p<0.05)。免疫荧光双标结果显示,ALS转基因新生鼠原代培养的脊髓星形胶质细胞中Wnt3a表达增强。(2) β-catenin在原代培养ALS新生鼠脊髓星形胶质细胞中的表达变化：与野生型新生鼠比较,ALS转基因新生鼠原代培养的脊髓星形胶质细胞中β-catenin蛋白表达上调,差异有统计学意义(p<0.05)。免疫荧光双标结果显示,ALS转基因新生鼠原代培养的脊髓星形胶质细胞中β-catenin表达增强。(3) Cyclin D1在原代培养ALS新生鼠脊髓星形胶质细胞中的表达变化：与野生型新生鼠比较,ALS转基因新生鼠原代培养的脊髓星形胶质细胞中CyclinD1蛋白表达上调,差异有统计学意义(p<0.05)。免疫荧光双标结果显示,ALS转基因新生鼠原代培养的脊髓星形胶质细胞中Cyclin D1表达增强。3. Wnt/β-catenin信号通路关键信号分子在ALS细胞模型中的表达变化(1) Wnt3a在ALS细胞模型中的表达变化：与pEGFP-WT-SODl转染的N2a细胞比较,pEGFP-G93A-SOD1转染的N2a细胞中Wnt3a蛋白在24h和48h表达均下调,差异均有统计学意义(p<0.05)。免疫荧光染色结果显示,24h和48h, Wnt3a在pEGFP-G93A-SOD1转染的N2a细胞中表达均降低。(2) β-catenin在ALS细胞模型中的表达变化：与pEGFP-WT-SOD1转染的N2a细胞比较,pEGFP-G93A-SOD1转染的N2a细胞中β-catenin蛋白在24h和48h表达均下调,差异均有统计学意义(p<0.05)。免疫荧光结果显示,24h和48h, β-catenin在pEGFP-G93A-SOD1转染的N2a细胞中表达均降低。(3) Cyclin D1在ALS细胞模型中的表达变化：与pEGFP-WT-SOD1转染的N2a细胞比较,pEGFP-G93A-SOD1转染的N2a细胞中Cyclin D1蛋白在24h和48h表达均上调,差异均有统计学意义(p<0.05)。免疫荧光结果显示,24h和48h,在pEGFP-G93A-SOD1转染的N2a细胞中Cyclin D1表达均增强。[结论]1.ALS发病过程中,Wnt3a、Wnt2、Wnt7a表达上调,激活Wnt/β-catenin信号通路,上调靶基因Cyclin D1的表达,与ALS脊髓运动神经元的退行性变和星形胶质细胞增生密切相关。2. Wnt/β-catenin信号通路的关键信号分子Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1在原代培养的ALS脊髓星形胶质细胞中表达上调。3.突变的SOD1下调Wnt/p-catenin信号通路的关键信号分子Wnt3a、3-catenin在N2a神经细胞中的表达,上调靶基因Cyclin D1在N2a神经细胞中的表达。综合本研究,结果表明Wnt/β-catenin信号通路在ALS发病中发挥重要作用,Wnt/β-catenin信号通路异常与ALS发生发展密切相关。