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研究目的:血管重构是高血压病发生发展和靶器官损伤的关键病理学基础。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)异常增殖是血管重构的中心环节。血管紧张素II(AngⅡ)是肾素-血管紧张素系统(RAS)最重要的活性成分,循环或局部RAS激活可导致血管局部的AngⅡ浓度增加,通过促进VSMC增殖和迁移,促进高血压血管重构的形成和发展。ANO1是新发现的钙激活氯通道,在血管组织具有广泛的分布。已证明ANO1参与血管收缩活动和血压的调节,但是ANO1和血管重构的研究报道较少。本实验为探讨ANO1在AngⅡ诱导的VSMC增殖的作用,首先观察AngⅡ对ANO1表达的影响及受体机制。其次,通过应用ANO1抑制剂T16A inh-A01(A01),观察了A01对AngⅡ诱导的VSMC增殖的影响并探讨相关机制。研究方法:取正常大鼠胸主动脉,以组织贴块法进行VSMC的原代培养。通过MTT法检测细胞活力,通过Western blot法检测各种蛋白水平的变化。研究结果:1.为观察AngⅡ对ANO1蛋白表达的影响(量-效和时-效关系),细胞中加入不同浓度AngⅡ(1、10、100、500、1000 nmol/L)处理24 h,ANO1蛋白水平分别增至(1.09±0.03)、(1.17±0.02)、(1.46±0.07)、(1.21±0.01)、(1.17±0.01)(F=17.03,q=5.74~12.28,n=4,P<0.05-0.01),100 nmol/L AngⅡ上调ANO1的作用最显著。以100 nmol/L AngⅡ处理不同时间(1、6、12、24、48 h),ANO1蛋白水平分别为(1.13±0.08)、(1.25±0.15)、(1.80±0.08)、(1.74±0.06)和(1.65±0.04),AngⅡ作用12-48 h后ANO1表达明显增加(F=15.05,q=7.36~9.08,n=4,P<0.05-0.01)。以上结果表明:AngⅡ以浓度和时间依赖性方式促进ANO1表达。后续实验均选用100 nmol/L AngⅡ处理细胞24 h。2.为探讨AngⅡ上调ANO1表达的受体机制,AngⅡ(100 nmol/L,24 h)处理前分别加入AT1R阻断剂(氯沙坦钾,LP)和AT2R阻断剂(PD123319,PD),观察它们对ANO1蛋白表达的影响。结果发现:AngⅡ处理后,ANO1蛋白水平升高至(1.45±0.08),AngⅡ+LP组ANO1蛋白水平明显减少(0.95±0.09),而AngⅡ+PD组无显著改变(1.41±0.03)(F=9.68,q=5.31~5.87,n=3,P<0.05)。以上结果提示,AngⅡ促进ANO1表达的作用是通过它和AT1R结合所介导的。3.本研究还观察了ANO1抑制剂T16A inh-A01(A01)对AngⅡ诱导的ANO1上调的影响。AngⅡ组ANO1的蛋白水平增加至(1.39±0.08),而20μmol/L A01+AngⅡ处理组的蛋白水平降至(1.09±0.04)(F=14.88,q=5.65~7.37,n=6,P<0.01)。以上结果显示,ANO1抑制剂A01能够明显抑制AngⅡ诱导的ANO1蛋白表达。4.采用MTT法检测了不同浓度A01对AngⅡ处理的细胞活力的影响。以不同浓度AngⅡ(1、5、10、100、500、1000 nmol/L)处理细胞24 h,细胞存活率分别为(1.05±0.05)、(1.09±0.03)、(1.29±0.07)、(1.61±0.03)、(1.66±0.06)、(1.66±0.06)(F=30.02,q=5.53~12.17,n=6,P<0.05-0.01),提示10-1000nmol/L AngⅡ均具有促进VSMC细胞活力的作用。不同浓度(1、5、10、20μmol/L)A01与100 nmol/L AngⅡ处理细胞24 h,细胞存活率为(1.12±0.01)、(1.09±0.01)、(0.84±0.01)、(0.78±0.01)(F=57.96,q=19.69~22.85,n=6,P<0.01)。结果显示,10-20μmol/L A01能够明显抑制AngⅡ诱导的VSMC细胞增殖。5.通过检测PCNA蛋白表达进一步明确A01对AngⅡ诱导的细胞增殖的抑制作用。100 nmol/L AngⅡ组处理细胞24 h,PCNA蛋白水平升高至(1.62±0.08);20μmol/L A01+AngⅡ组的PCNA蛋白水平降至(1.06±0.01)(F=18.47,q=7.97~8.85,n=3,P<0.01)。以上结果进一步提示A01能够显著抑制AngⅡ诱导的细胞增殖。6.本实验旨在探讨A01抑制AngⅡ诱导的细胞增殖是否与p21、p27有关,结果发现:100 nmol/L AngⅡ处理24 h,p21蛋白水平降至(0.70±0.02),而A01+AngⅡ处理组p21表达升高至(1.04±0.01)(F=17.44,q=8.22~9.36,n=3,P<0.01)。p27蛋白的改变在各组同p21相似。由此可见,AngⅡ通过抑制p21、p27蛋白表达促进细胞周期进程,使VSMC增殖,而A01可以抑制该作用。7.通过MTT检测,首先观察PI3K抑制剂(LY294002,LY)对AngⅡ诱导的细胞增殖的影响。100 nmol/L AngⅡ处理24 h,细胞存活率升高至(1.62±0.05),LY+AngⅡ组存活率降至(0.98±0.04)(F=44.56,q=13.64~13.95,n=6,P<0.01),提示PI3K/AKT信号通路参与AngⅡ诱导的细胞增殖。通过Western blot检测,观察了A01对AKT蛋白的影响。100 nmol/L AngⅡ处理不同时间(5、15、30、60、180 min),p-AKT/AKT分别为(1.57±0.01)、(0.96±0.05)、(0.63±0.02)、(0.66±0.06)、(0.65±0.04)(F=57.14,q=12.02,n=3,P<0.01)。结果显示,AngⅡ处理5 min可导致AKT的迅速激活,但是很快出现下降趋势。20μmol/L A01+AngⅡ处理5 min,p-AKT/AKT降至(1.02±0.05)(F=24.26,q=7.27~7.62,n=3,P<0.01)。以上结果说明,AngⅡ促进细胞增殖的作用和快速激活AKT信号通路有关,A01可以通过抑制AKT信号通路拮抗AngⅡ的促增殖作用。8.通过MTT检测,首先观察MEK抑制剂(PD98059,PD)对AngⅡ诱导的细胞增殖的影响。100 nmol/L AngⅡ处理24 h,细胞存活率升高至(1.62±0.05),PD+AngⅡ处理24 h,存活率降至(1.03±0.03)(F=41.86,q=12.29~13.05,n=6,P<0.01),提示MEK/ERK信号通路参与AngⅡ诱导的细胞增殖。通过Western blot检测,观察了A01对ERK蛋白的影响。100 nmol/L AngⅡ处理细胞不同时间(5、15、30、60、180 min),p-ERK/ERK比值分别为(2.82±0.24)、(2.35±0.01)、(1.89±0.09)、(1.69±0.01)和(1.44±0.05)(F=35.72,q=6.31~16.72,n=4,P<0.05-0.01),说明AngⅡ处理5 min能迅速激活ERK信号通路,并且能够持续较长时间(60 min);A01+AngⅡ组处理细胞5 min,p-ERK/ERK降至(0.90±0.10)(F=21.89,q=7.49~8.85,n=4,P<0.05-0.01)。以上结果说明,AngⅡ促增殖作用还和ERK信号通路激活有关。A01可通过抑制ERK信号通路,抑制AngⅡ诱导的细胞增殖。结论:AngⅡ能够以浓度和时间依赖性方式促进VSMC ANO1的蛋白表达,AngⅡ上调ANO1的作用是通过结合AT1R而实现。ANO1特异性抑制剂A01显著抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖,提示AngⅡ的促增殖作用可能有ANO1通道蛋白的参与。此外,A01抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖和上调细胞周期负性调控蛋白p21、p27以及抑制AKT、ERK信号通路有关。