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γδTCR，αβTCR和抗体是通过胚系基因片段重排形成的抗原受体。三者通过V、D、J胚系基因重排产生了各自的抗原识别受体库。在免疫系统中，它们有着不同的功能和作用。目前人们对αβT和B细胞的功能、抗原识别特点及抗原识别的结构基础都已很明确。近几十年来，尽管对γδT细胞的研究也取得了很大的进展，但人们对γδTCR配体识别的结构基础尚不完全明了，而且γδTCR的配体鉴定方面的进展也较缓慢。一般认为，TCR的互补决定区（CDR）3在与其抗原结合时发挥主要作用，但在CDR3片段内究竟哪一部分序列对其抗原特异性结合发挥关键作用尚不清楚。另外，由于γδT细胞以MHC非限制性直接识别和结合抗原而无需抗原提呈，通过细胞毒作用和产生细胞因子来发挥效应功能，抗原识别谱广泛，能够对某些NK细胞敏感或非敏感肿瘤细胞产生杀伤溶解作用等特点使其在肿瘤免疫中的作用越来越引起人们的关注。若能寻找到γδT细胞的刺激配体，尤其是肿瘤相关抗原表位（TAA）或肿瘤特异的抗原表位（TSA），使其在体内激发γδT细胞的抗肿瘤活性，这种特异性的肿瘤杀伤效果会更佳。但目前研究的比较清楚的γδT细胞的刺激配体寥寥无几。有学者试图用游离的或转染的γδTCR受体去筛选肿瘤相关的抗原表位，但没有获得满意的结果。本研究首先旨在澄清TCR2-CDR3与其肿瘤靶细胞／组织特异性结合的分子结构基础，通过分析卵巢上皮癌（OEC）组织中γδ型肿瘤浸润淋巴细胞（γδTIL）的CDR3序列，继而合成TCR CDR3δ相应多肽，并通过侧翼序列或中间多变序列各种突变体的制备，利用荧光免疫、酶免疫、表面等离子共振技术（SPR）等技术来观察上述多肽与肿瘤细胞系／组织的结合特性，以期阐明CDR3δ区域内各序列的结合作用；进一步阐明γδTCR与其配体相互作用的分子机制；其次，在上述研究基础上，我们提出了一种筛选抗原表位的新策略：利用TCRδ-CDR3合成肽从噬菌体随机十二肽库中钓取抗原表位。由于γδT细胞识别抗原的方式是由γδTCR的V-（D）-J连接区基因编码的氨基酸完成的，它与免疫球蛋白的CDR3区相对应，并且TCRδ链连接区具有非常高的多样性，这意味着δ链在抗原识别中发挥着重要作用。鉴于δ链CDR3的重要性，我们尝试用TCRS-CDR3来钓取抗原。本研究完成的主要工作及其结果如下：一、γδT细胞与抗原特异性结合机制的探讨1、卵巢上皮癌（OEC）肿瘤浸润TCRδ2-CDR3序列特点的分析为了了解TCRVδ2-CDR3的序列特征，我们对来自卵巢癌组织γδTIL的TCRδ2-CDR3片段进行了克隆和测序。结果显示，TCRδ2-CDR3序列由两端保守的侧翼序列和多变的中间序列组成。2、CDR3δ在抗原结合中的作用根据对TCRδ2-CDR3长度和序列的分析，我们选择合成了两条TCRδ2-CDR3肽，同时合成了相应的对照肽，为了确保我们实验结果的可靠性和重复性，我们采用了不同的方法包括流式细胞术、激光共聚焦扫描显微镜（Confocal）、免疫组化、SPR和CDR38介导的酶联免疫吸附（CDR38-EIA）等实验，从细胞水平、组织水平、蛋白水平和分子水平对CDR3δ合成肽与可能配体的结合进行了检测。我们的数据显示，来源于OECγδTIL的CDR3δ合成肽能够结合OEC细胞、OEC组织和OEC蛋白提取物，但不与正常细胞、正常组织和正常细胞蛋白提取物结合。此外，CDR3δ合成肽也能与其他类型的肿瘤组织包括胃癌、肝癌、结肠癌或肿瘤细胞发生反应。总之，来源于OECγδTIL的CDR38肽显示了肿瘤结合特异性。3、CDR38的侧翼序列是抗原结合特异性的关键决定簇为了进一步探讨CDR3δ与配体作用的分子机制—多变的中间序列和两端保守的侧翼序列对肿瘤结合特异性的作用，我们分别突变了TCR82-CDR3肽两端保守的侧翼序列和多变的中间序列，合成了相应的对照肽，然后，利用上述实验系统研究了合成肽和不同肿瘤细胞或OEC组织的结合作用。流式细胞术，Confocal和免疫组化的结果均显示：保留两端保守的侧翼序列突变中间序列的合成肽能与靶细胞特异性结合，而保留中间序列突变侧翼序列的合成肽不能特异性结合靶细胞。这表明，两端保守的侧翼序列而非中间多变序列对TCRδ2-CDR3与靶细胞的特异性结合起关键作用，突变中间的多变序列可能减弱这种结合作用。二、利用TCRδ2-CDR3合成肽从噬菌体随机十二肽库中钓取抗原表位的新策略1、CDR3δ合成肽能够封闭γδT细胞对靶细胞的杀伤作用为了说明TCRδ2-CDR3肽识别的抗原与天然的γδTCR识别的抗原是否一致，我们用MTT法杀伤封闭实验来进行了验证。实验结果显示CDR3δ合成肽能够部分封闭γδT细胞对卵巢癌细胞系SKOV3细胞的杀伤活性。这提示TCRδ2-CDR3识别的抗原与天然的γδTCR识别的抗原基本一致。2、TCRδ链CDR3合成肽对噬菌体随机展示肽库的筛选及筛选表位的验证随后，经过四轮筛选，我们用合成的TCRδ2-CDR3肽OT3和OT1从噬菌体随机十二肽库中分别钓取到两条抗原表位多肽Ag1和Ag2，并且对这两条抗原表位多肽的功能进行了验证。结果显示，Ag1和Ag2均能在体外诱导人类γδT细胞的增殖，并且可在体外从PBMC中选择性扩增γδT细胞。这一实验结果证明我们的策略是可行的。本研究证实了CDR3δ在抗原结合中的关键作用即CDR3δ决定抗原结合的特异性，并且首次发现CDR3δ侧翼序列的V和J片段决定CDR3δ与配体的结合特异性，而中间序列可能影响这种结合的亲和力。这一发现为γδTCR识别抗原的有限多样性提供了结构生物学的证据。此外，我们首次提出了利用TCRδ2-CDR3合成肽从噬菌体随机十二肽库中钓取抗原表位的新策略，并且通过实验验证了这一策略是完全可行的。利用这一策略将为γδT细胞所识别的肿瘤抗原表位或肿瘤相关抗原表位的大量发现提供新思路和技术支持，进而为肿瘤的诊断、免疫治疗提供更多更的生物标记物或治疗靶点，为围绕γδT细胞所进行的肿瘤治疗的应用开发奠定坚实的基础。