目的 探讨同种异体黑素细胞治疗白癜风的可行性。白癜风常见且难治。白斑部位缺少能够分泌黑素颗粒的黑素细胞。对稳定期患者目前以自体含黑素细胞的皮片移植获得了很好的疗效，但该方法要从患者自体正常部位皮肤取皮，而且获得黑素细胞有限，难以解决大面积皮损治疗问题。基于一些体外研究发现黑素细胞免疫原性较弱，不容易刺激异体黑素细胞增殖，以及异体表皮细胞移植的一些进展，有的学者推测异体黑素细胞移植到白癜风患者时排斥反应可能较小，如果能存活并产生黑素颗粒，则可能成为治疗白癜风的一种新途径。本课题组在综合各种资料及分析论证后于5年前进行了临床试验：在不配型、不使用免疫抑制剂情况下，对11例白癜风志愿者移植了同种异体黑素细胞，术后随访90天，3例患者有部分色素恢复，其中1例患者效果明显。其后上海华山医院、杭州三院的一些学者在会议上报告异体黑素细胞移植后有的白癜风皮损出现色素恢复。 但除本课题组的研究结果外，国内外至今仍无正式论文发表。分析主要问题可能在于该方法临床治疗方法尚不成熟，效果仍不确切，影 第四军医大学博士学位论文响治疗效果的可能因素有:免疫排斥、移植的黑素细胞数量、细胞质量、产生黑素颗粒的功能、移植操作过程中细胞丢失以及白癫风局部的微环境等。 为了进一步探索异体黑素细胞移植的可行性，找到影响疗效的主要因素，提高其临床疗效，本课题首先利用组织工程技术，优化培养黑素细胞，尝试培养黑素细胞的前体细胞，然后选择生物材料复合黑素细胞以防止移植细胞流失，尝试制备含超高浓度黑素细胞的三维膜片，最后进行异体黑素细胞移植临床探索。 方法 第一部分优化培养黑素细胞，扩大种子细胞来源 一、两段法培养适合移植的高纯度黑素细胞。先用含12一O一十四烷酞佛波醇一13一乙醋(phor匕01 ester 12一。-tetradecanoylphorbol一13一aeetate，TpA)的培养基从健康青少年包皮中培养纯化黑素细胞，然后改用不含TPA的培养基培养传代。观察去掉TPA后黑素细胞的形态变化和生长状况，以建立适合更佳安全高效的黑素细胞培养方法。 二、用胶原酶消化胎儿头皮毛囊，培养外毛根鞘细胞，观察外毛根鞘细胞和黑素细胞分布;然后筛选培养黑素(母)细胞。 三、从流产胎儿面突组织中分离外胚间充质干细胞，用磁珠分离LNGFR(+)神经峭细胞，用抗鼠HNK一l(CD57)单克隆抗体和抗Nestin单抗鉴定其来源;同时诱导外胚间充质千细胞向黑素细胞方向分化，以获得胚胎源性黑素母细胞。 第二部分选用组织工程材料，改进细胞移植方法 一、观察不同浓度的透明质酸对贴壁生长黑素细胞的酪氨酸酶活性和增殖的影响，观察透明质酸混悬是否影响黑素细胞的贴壁和增殖。 二、在BioFOLIE膜上接种黑素细胞制备二维细胞膜片，用扫描、 第四军医大学博士学位论文透射电镜观察黑素细胞在BioFOLIE膜上生长状况。观察冻存复苏后该膜片上黑素细胞的活力。 三、尝试用胶原凝胶制备三维含黑素细胞表皮替代物。把角质形成细胞和黑素细胞混合培养，与胶原凝胶复合，制成含黑素细胞的三维膜片，观察所制表皮的颜色变化;切片染色检查表皮结构和黑素细胞分布:观察所制表皮接受紫外线照射后的颜色改变。 第三部分同种异体黑素细胞移植治疗白瘫风临床研究 用自建两段法从幼儿环切包皮培养大量黑素细胞，移植前3天制备超高浓度的黑素细胞膜片:用胶原凝胶混悬黑素细胞沉淀，放入12孔板中置37℃孵育凝固，在其表面接种黑素细胞。继续培养制成每平方厘米含lx10“个黑素细胞的膜片备用。移植当天另外制备高浓度 (0.5一3 x 106个黑素细胞/耐)和低浓度(0.5一3 xl扩个黑素细胞/ml)黑素细胞悬液，吸入空注射器备用。 移植术前对患者白斑部位用长波紫外线UVA照射一次。 在不使用免疫抑制剂、供受体事先不配型的前提下，对12例稳定期白痴风志愿者进行同种异体黑素细胞移植，主要采取两种方式:1，疙内注射法:参照以往方法用表皮分离机在白斑区吸疙，从疤顶吸出疙液，注入准备好的异体黑素细胞悬液，每疙注入0.1毫升。2，细胞膜片法:用SilktouCh扫描器激光磨削疮周白斑制成合适的移植床，然后贴附上异体黑素细胞膜片。术后用金属罩保护，防止水疙受压细胞流出。患者术后就地休息lh。设置自体表皮皮片移植对照和疤内注射生理盐水空白对照。 移植后10一13天时拆除敷料。术后约30、60、90、120、180天时复诊，记录颜色恢复情况。复诊时用UVA照射移植部位一次，照射 时间每次增加10秒钟。动员患者取活检做病理检测。结果第一部分优化培养黑素细胞，扩大种子细胞来源 第四军医大学博士学位论文 一、用含TpA的培养基容易纯化培养出黑素细胞。换用不含TPA的培养基后细胞形态变化明显:由细长形逐渐变宽，胞浆增多，多极变为双极或成多边形。细胞核型分析结果均为正常二倍体细胞。细胞增殖略微减慢。 二、根据部位