【摘 要】
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结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）是一种人畜共患的胞内寄生菌,具有非常强的逃避宿主免疫应答并导致长期潜伏感染的能力,能够引起人及动物结核病。牛分枝杆菌卡介苗（Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin,M.bovis BCG）是目前唯一可用于人结核病防治的疫苗,虽然其免疫效果并不理想,但是也毋庸置疑地拯救了数以百
【基金项目】
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国家重点研发计划“病原菌逃逸宿主免疫与胞内存活的分子机制”（课题编号:2017YFD0500305）；
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结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）是一种人畜共患的胞内寄生菌,具有非常强的逃避宿主免疫应答并导致长期潜伏感染的能力,能够引起人及动物结核病。牛分枝杆菌卡介苗（Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin,M.bovis BCG）是目前唯一可用于人结核病防治的疫苗,虽然其免疫效果并不理想,但是也毋庸置疑地拯救了数以百万的生命。BCG的本质为牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis,M.bovis）体外传代致弱株,与结核分枝杆菌高度同源,但毒力降低了很多,因此常用于作为结核病研究的模式菌株。细菌对宿主细胞的侵袭能力的强弱常用来反映细菌毒力的大小;由侵袭相关基因所编码的侵袭相关蛋白直接影响着细菌的侵袭能力。因此,侵袭相关基因的筛选及鉴定,不仅有助于结核分枝杆菌与宿主细胞互作机制的研究,更为新型疫苗研发奠定了重要的基础。本研究利用携带有Himar1转座子的温敏型噬菌体Myco Mar T7系统成功构建了牛分枝杆菌BCG随机突变体文库;并利用细胞侵袭模型对文库中突变株进行了筛选,得到了28株侵袭能力降低,36株侵袭能力增强的突变菌株。对侵袭能力降低的28株突变子进一步进行了定量检测分析,确定了其中10株具有稳定的侵袭能力。通过测序确定了其中有效突变株为7株。对其中编号为B2801,B2855,B2909的3株突变株进行了逐一验证。该3株突变株的相关基因分别为BCG-2658,Lip Q,Fad D18,因此将该3株突变株分别命名为BCG::Tn-2658,BCG::Tn Lip Q,BCG::Tn Fad D18。为确定该3株突变株的毒力,对这3株突变株从生长性能、黏附能力、形态学、胞内存活能力等进行了测定。生长曲线结果显示:3株突变菌株在对数期的生长速度均显著高于野生菌株,生长迅速;与野生株相比,BCG::Tn Fad D18黏附能力显著降低（P＜0.01）,BCG::Tn-2658和BCG::Tn Lip Q的黏附能力无明显差异（P＞0.05）。形态学观察结果显示:BCG::Tn-2658单菌落大小显著小于野生菌株,且索状结构明显消失;BCG::Tn Lip Q和BCG::Tn Fad D18的单菌落形态与野生株相比无明显差异。对BCG::Tn-2658在巨噬细胞内的存活能力进行检测。结果显示:感染4h后BCG::Tn-2658胞内存活能力相较野生株显著降低2倍（P＜0.01）,12h后两者无显著差异。为了进一步验证突变株BCG::Tn-2658、BCG::Tn Lip Q和BCG::Tn Fad D18的功能,构建了这3个突变株的回补菌株。结果显示:BCG::Tn-2658、BCG::Tn Lip Q和BCG::Tn Fad D18的回补菌株构建成功。
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