基于核酸适配体的液晶传感器检测生物分子

来源 :重庆医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:myg3801403
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随着近年来指数富集配基系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)技术的发展,越来越多的核酸适配体(Aptamer)被筛选出来,成为传感器构成中非常重要的元件。核酸适配体优于抗体之处主要体现在:其亲和力和特异性都高于抗体,可以在体外大量的人工合成,成本低,易于保存等。因此,有“人工抗体”之称的核酸适配体被越来越多地引入到传感器检测的领域中来。液晶(Liquid Crystal,LC),是一类介于固体和液体间的特殊形态的物质,其独特和灵敏的取向响应及光学各向异性等性质使其成为新颖的信号放大与换能元件。用高特异性的核酸适配体充当分子识别元件,并结合液晶材料灵敏的光学响应,即可搭建出一个生物分子的传感检测体系—基于核酸适配体的液晶传感器。其基本检测原理为:将待测生物分子的核酸适配体以最佳化比例固定于玻片表面,并使其上的液晶分子呈垂直取向,此时偏光图像为均一的黑色;当玻片表面存在目标检测物时,核酸适配体与检测物发生特异性结合,进而改变玻片表面的地貌及化学组成,使其上的液晶分子产生取向改变,最终引起偏光图像的变化,完成对目标物的检测。目前基于核酸适配体液晶传感器检测生物分子的报道比较少,更没有人将其作为一个专门体系来进行探讨。本研究就是要完善和优化这一检测体系,探索利用此传感检测体系更有效地提高对生物分子检测的灵敏度和特异性。本文围绕这些拟解决的问题,主要做了以下工作:(1)抗生素的残留问题是目前困扰人类健康的重大问题,卡那霉素是应用广泛甚至泛滥的一类氨基糖苷类抗生素,目前已报道的检测方法中并未有本论文所提出的基于核酸适配体的液晶传感器技术,因此用核酸适配体的液晶传感器实现对卡那霉素的检测有重要的实际意义。实验首先用两种硅烷类物质:3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、N,N-二甲基-N-十八烷基-3-氨丙基硅烷(DMOAP)以及另一种醛类物质戊二醛(GA)混合组装传感器基底;之后在基底表面固定修饰了氨基的核酸适配体。当卡那霉素存在时,会与传感器基底上已经固定的核酸适配体反应并形成G-四聚体结构,破坏液晶传感器基底的地貌形态,改变液晶分子的均一取向,从而能够高灵敏度检测出卡那霉素。该方法可以获得1 n M的卡那霉素检测限,且特异性好,操作方便,为下一步优化这一检测体系打下基础。(2)用基于核酸适配体的液晶传感器完成了对肺表面活性蛋白A(Pulmonary surfactant protein A,SP-A)的检测。采用基于核酸适配体的液晶传感检测体系,将SP-A核酸适配体修饰到APTES+GA/DMOAP的分子自组装膜表面,只有SP-A才可以被SP-A核酸适配体特异性识别,从而扰乱基底表面液晶的垂直取向,能够有效的检出目标物。利用本课题提出的这一传感体系,可以最低检测到5 nM的SP-A。同时,在此基础上,我们对实验结果也做了更深入的分析和研究:处理不同浓度的目标检测物所对应的不同偏光图像,提取它们所对应的平均灰度值(即彩色图像的平均亮度值)做初步的定量分析的探索。研究结果表明,液晶光学图像的平均亮度值随着SP-A检测浓度的升高而升高。这一探索,为液晶传感器检测结果的处理和分析提供了新思路。(3)提出了金纳米粒子信号增强的核酸适配体液晶传感器用于莱克多巴胺(Ractopamine,RAC)的检测方法。为了提高核酸适配体液晶传感检测体系的检测性能,本章引入了金纳米粒子进行信号增强用于考察对莱克多巴胺的检测。首先,利用与前面章节相同的分子自组装膜(APTES+GA/DMOAP),提供一个既可以固定莱克多巴胺核酸适配体又可以诱导液晶垂直排列的基底。为了达到信号增强的目标,将纳米金溶液与检测物莱克多巴胺制成均匀、稳定的混合溶液,当莱克多巴胺存在时,基底上修饰的莱克多巴胺核酸适配体与其发生特异性结合,从而在传感界面上形成能够显著扰乱液晶分子垂直排列的纳米金-莱克多巴胺-核酸适配体复合物,达到信号增强的目的。该方法可以大大提高检测灵敏度,检测限低至1 pmol?L-1(相当于0.3 pg?mL-1)。值得注意的是,此方法中金纳米颗粒不需要像传统方法那样预先被修饰于核酸适配体上。本研究提供了一种无需标记、灵敏、新颖的莱克多巴胺的检测方法。(4)为了降低传感基底制备的难度,本课题进一步尝试直接利用单链DNA(ss DNA)作为液晶的垂直取向剂,用于检测DNA分子杂交。实验选择合适长度和浓度的ssDNA,借助于三乙氧基丁醛硅烷(TEA)在传感器的基底表面形成合适表面覆盖率的分子膜,实现既可以让液晶有序排列,又能识别互补链的DNA杂交的检测。当传感器基底上只存在一定覆盖率的ssDNA时,不会破坏液晶分子的垂直取向,而当有互补链存在时,ssDNA会与其杂交生成双链DNA,导致液晶的有序取向被破坏,出现由黑到彩的光学图像的改变。该检测方法检测灵敏度高,无需标记,特异性好,为基于核酸适配体的液晶传感器检测方法开辟了新发展方向。
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