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研究背景和目的：前列腺癌(PCa)和前列腺增生(BPH)是泌尿外科常见的老年男性疾病,我国13.6%的老年男性患前列腺增生症；在西方国家,前列腺癌死亡人数仅次于第一位的肺癌。当前临床诊断中主要使用前列腺特异抗原(PSA)作为前列腺癌和前列腺增生的主要鉴别诊断手段,用Gleason评分来进行前列腺癌病理分级,用肿瘤恶性程度进行前列腺癌细胞恶性分级,用TNM分期进行前列腺癌临床分期。然而由于PSA并非前列腺癌细胞所特有,前列腺增生、前列腺炎,甚至乳腺癌等多种疾病亦会引起血浆中PSA升高。当PSA在4～10ng/ml时,难以区分PCa和BPH。而进行Gleason评分时以及肿瘤细胞的恶性程度受到病理医生的主观看法和经验的影响,也不可能对前列腺癌的恶性程度进行客观,准确的判定。因此临床有必要寻找比PSA更可靠的诊断指标,比Gleason评分及肿瘤恶性程度分级更客观的病理分级指标。近年来,SOX家族日益被人们所重视。其中的SOX9基因在前列腺组织中特异性表达。雄激素通过激活雄激素受体(AR),一方面引发级联反应,导致前列腺癌的形成。另一方面,SOX9基因可以促进前列腺癌细胞株中肿瘤细胞的变异和分化,激活基因表达SOX9分子,使SOX9表达量也在前列腺癌组织中上调表达。提示检测前列腺组织中SOX9基因的表达值可以有助于前列腺癌的早期诊断和恶性程度的评估。NM23基因是一种肿瘤定位的基因,该基因在肿瘤的转移过程中起着负性调控作用。它通过调节细胞的增生、分化、凋亡以及与细胞间的相互作用在许多生理和病理过程中发挥重要的调控作用。实时荧光定量PCR技术(fluorescence quantitative realtime polymerase chain reaction, FQ-RT-PCR),是指在PCR反应体系中加入荧光基团或染料,利用荧光信号的变化实时监测PCR反应过程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。定量原理是PCR反应时发射的荧光信号达到检测域值时的循环数(Cycle threshold, Ct),即Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始拷贝数越多,Ct值越小。实时荧光定量RT-PCR在反转录反应后,进行实时荧光定量PCR反应,反应结果与标准曲线对照,可获得样品的起始模板量。本论文利用实时荧光定量PCR对良性前列腺增生和前列腺癌的组织中SOX9和NM23基因表达量进行定量检测。结合临床中良性前列腺增生的病理诊断和前列腺癌的Gleason评分,肿瘤恶性程度分级以及前列腺癌的临床分期,探讨SOX9和NM23基因在前列腺癌的诊断和病理分级中的意义,对肿瘤的无进展生存期的指导作用,进一步认识SOX9和NM23基因的生物行为学特征。并探讨其数值对前列腺癌各项指标的临床指导意义。材料和方法：收集广州市第一人民医院和广州医学院第二附属医院泌尿外科2009年12月至2012年12月收治的100例前列腺癌病人和80前列腺良性增生病人的临床开放手术,TURP(经尿道前列腺切除术)切下的组织、穿刺活检组织。正常前列腺组织由行膀胱癌根治术后标本获得。取得样本后,马上放入液氮瓶中速冻收集保存。其中PCa患者平均年龄73.5岁；BPH患者平均年龄68.3岁；正常前列腺3例,平均年龄58岁。并记录石蜡切片观测样本的病理恶性程度分级,Gleason评分,记录病例的临床分期和肿瘤的无进展生存期。患者的随访终点为：PSA连续两次随访再次升高,以第一次升高的时间为随访终点；或者核素骨扫描提示骨转移；或者经直肠超声、CT、MR等影像学检查提示前列腺癌局部进展或死亡。随访最后截止日期：2012年12月31日。运用实时荧光定量PCR测定标本中SOX9和NM23基因的表达量比较良性前列腺增生和前列腺癌SOX9和NM23基因表达值：(1)以临床样本提取组织样本。(2)应用Takara Taq HS试剂。(3)使用仪器为荧光定量PCR仪RotorGene2000(Corbett公司),荧光定量PCR分析软件用Rotor-gene v5。(4)提取mRNA。(5)从NCBI的gene bank中检索SOX9和NM23及β-actin基因的uniGene资料,从中获得各基因的Normal mRNA序列及相关uniSTS。用VectorNT6.0软件(Informax)定位相关uniSTS扩增片段在Normal mRNA中的位置,选择长度在100-300bp,且位置近mRNA3’端的uniSTS序列。最后再经NCBI网站的Blast软件分析和e-PCR软件确认该片段的特异性,剔除特异性较差和e-PCR结果中有重复的uniSTS引物。根据TMPRSS2和KLK11基因的mRNA序列及相关UniSTS序列,并考虑杂交和反转录标记的要求,以及ePCR结果,分析筛选到具有较好的特异性的序列。制作相应的SOX9和NM23探针序列和其相应的UniSTS引物序列。(6)对RNA样本进行实时荧光定量PCR。(7)制作标准曲线。(8)运用相对定量方法对数据进行处理。统计学处理：良性前列腺增生症和前列腺癌的SOX9和NM23mRNA表达量(Ct值)进行独立样本t检验。将肿瘤恶性程度分为G1-G2以及G3两组,Gleason评分分为大于6以及小于等于6组,临床病理分期分为Ⅰ-Ⅱ组以及Ⅲ-Ⅳ组。对其肿瘤组织中的SOX9和NM23mRNA表达量(Ct值)进行独立样本的t检验。对肿瘤恶性程度(G1-G2和G3),Gleason评分(小于等于6和大于等于6),肿瘤的临床分期(Ⅰ-Ⅱ和Ⅲ-Ⅳ)分组不同的无进展生存期差异,进行log-rank检验,并分别采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线；多因素分析采用Cox比例风险回归模型进行分析。将单因素分析中有统计学意义的临床病理因素：Gleason评分、临床分期、SOX9/NM23Ct值纳入Cox比例风险回归模型进行综合分析,变量筛选采用逐步向前回归法,以P≤0.05为纳入标准,P>0.10为剔除标准。结果：1、对良性前列腺增生症和前列腺癌的SOX9和NM23mRNA表达量(Ct值)进行独立样本t检验,发现SOX9和NM23mRNA表达量在良性前列腺增生症和前列腺癌中的表达量有显著性差异(P<0.05), SOX9和NM23mRNA表达量在前列腺癌组织中比良性前列腺增生症组织中要高。2、对SOX9和NM23mRNA表达量(Ct值)在前列腺癌中不同的病理因素进行独立样本的t检验。发现在临床分期,Gleason评分,肿瘤恶性程度的不同分组中SOX9和NM231mRNA表达量(Ct值)均有显著性差异(P<0.05)。SOX9mRNA表达量(Ct值)随临床分期,Gleason评分,肿瘤恶性程度升高而升高。NM23mRNA表达量(Ct值)随随临床分期,Gleason评分,肿瘤恶性程度升高而降低。3、对各临床病理因素分组不同的无进展生存期差异,进行log-rank检验,发现肿瘤恶性程度、Gleason评分、临床分期、SOX9/NM23Ct值在单因素分析中是前列腺癌无进展生存期的影响因素。然后分别对Gleason评分、临床分期、肿瘤恶性程度和SOX9/NM23Ct值的不同分组绘制无进展生存曲线。在所有病例中,Gleason评分≤6分的病例无进展生存期长于Gleason评分>6分的病例(P<0.01,log-rank检验)。同样地,临床分期为Ⅰ-Ⅱ的比Ⅲ-Ⅳ的病例无进展生存期长(P<0.01,log-rank检验),肿瘤恶性程度分级为G1-G2的比G3的病例无进展生存期长(P<0.01, log-rank检验)。SOX9/NM23Ct小于2的比SOX9/NM23Ct值大于等于2分组的无进展生存期差异也有统计学意义(P<0.01, log-rank)。4、将单因素分析中有统计学意义的三项临床病理因素：Gleason评分、临床分期、SOX9/NM23Ct值纳入Cox比例风险回归模型进行综合分析,变量筛选采用逐步向前回归法,以P<0.05为纳入标准,P>0.10为剔除标准。最终确定Gleason评分(P<0.01)和SOX9/NM23Ct值(P<0.01)是影响前列腺癌无进展生存期的主要因素。结论：1、良性前列腺增生症中前列腺组织的SOX9和NM23mRNA的表达值与前列腺癌中SOX9和NM23mRNA的表达值有显著差异,通过检测组织中SOX9和NM23mRNA的表达值可作为鉴别良性前列腺增生症和前列腺癌的指标。2、前列腺癌组织中SOX9和NM23mRNA的表达值随着Gleason评分,临床分期,肿瘤恶性程度的不同而显示出差异。SOX9mRNA表达值随着Gleason评分,临床分期和肿瘤恶性程度升高而表达增强。NM23mRNA的表达值随着Gleason评分,临床分期和肿瘤恶性程度升高而表达下降。SOX9和NM23基因表达值的比值可作为前列腺癌病人无进展生存期的临床指标。3. SOX9/NM23Ct值有助于判断前列腺癌的无进展生存期,其数值小于2提示无进展生存期较长,其数值大于等于2提示无进展生存期较短。