群体感应(Quorum sensing,QS)是微生物中广泛保守存在的一种细胞与细胞间的通信机制,协调细菌各种群体活动,参与调控细菌的致病性。研究群体感应机制对控制和预防细菌感染至关重要。绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa),属假单胞菌属(Pseudomonas),采用由las、pqs及rhl调控系统组成的群体感应网络协调其毒力基因表达。其中las系统位于级联反应的顶端。不少临床分离株均发现中央las系统功能突变受损,张炼辉带领的团队于2013年首次发现绿脓杆菌中一种取代las的机制,并分离鉴定到一种新群体感应信号IQS,上连中央las系统和磷酸胁迫应激反应机制,下接pqs及rhl系统。阻断IQS合成导致pqs及rhl系统的群体感应并显著降低菌株毒力。IQS产生受las严格控制但同时也被磷酸贫乏状况激活,磷酸贫乏是细菌感染过程中的常见胁迫信号。低磷酸盐离子浓度条件下的绿脓杆菌,利用IQS系统,在低磷响应的转录激活因子PhoB的调控下,越过las系统,激活rhl以及pqs系统,表现生物毒性。本课题使用分子微生物学、基因组学、生物化学和分析化学的研究手段作为主要研究方法来研究IQS的生物合成途径。根据文献报道,四个在同一操纵子的基因(ambB、ambC、ambD和ambE)参与了IQS的生物合成。我们通过高效液相色谱HPLC和液质联用LC-MS的方法分析检测△amb突变体菌株,导入amb合成基因簇的大肠杆菌ambBCDE-DH5a的菌株和野生型PAO1菌株的中IQS相关信号的变化情况,发现amb基因突变不会导致IQS产量变化,且异源表达菌株未检测到IQS的峰(m/z 205),而是检测到抗代谢物AMB(m/z 131.06)的峰。结合生物信息学提供的NRPS合成基因预测,发现一组pch功能基因簇。早期的研究发现,pch基因簇参与了铁载体Pyochelin的生物合成。通过构建pchA、B、C、D、E、F和G的突变体,分别检测了突变体中IQS的产生情况。发现pch的突变体中,均检测不到IQS的产生;而在pchE(△pchE)互补体能恢复IQS产生。初步证明amb不是直接参与IQS的生物合成,而pch基因则参与合成IQS。IQS分子的的合成底物为1分子水杨酸(Sal)和1分子半胱氨酸(Cys),我们进行底物添加实验。向△pchA,△pchD,△pchE培养液中添加底物水杨酸,结合高效液相色谱分析明确相关重要基因的功能,初步阐明了IQS生物合成途径,证实IQS的前体为铁载体Pyochelin生物合成途径的中间产物。为阐明绿脓杆菌群体感应机理和致病调控机制奠定了基础。