【摘 要】
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本实验以中国农业大学戚金亮博士克隆到的小金海棠的抗缺铁相关基因Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因(MxIrt1)的cDNA全长为基础,进一步探讨了其编码蛋白的功能及其在细胞中的定位,为深入研究苹
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本实验以中国农业大学戚金亮博士克隆到的小金海棠的抗缺铁相关基因Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因(MxIrt1)的cDNA全长为基础,进一步探讨了其编码蛋白的功能及其在细胞中的定位,为深入研究苹果抗缺铁的分子机理奠定了基础。 本论文首先构建pDBLeu-IRT酵母表达载体,其次转化酵母突变株DDY4(fet3fet4),先利用SD-极限培养基进行营养缺陷筛选阳性克隆,然后转入含有BPDS(铁离子螯合剂)的YPD固体培养基,进行功能验证。结果表明,非转化菌株在此固体培养基上不能正常生长,而转化有pDBLeu-IRT的酵母突变株可以很好的生长。说明IRT蛋白可以作为一种铁离子转运体补偿铁转运体双突变株的功能。 因为IRT是二价铁高效转运蛋白,当它在酵母体内表达后,可以较高效率地转运铁离子进入酵母体内,使酵母体内的铁含量处于较高水平,因此通过测量不同酵母体内(包括突变体,转化的突变体,野生型菌株)的铁离子含量可以更好地确认该转运蛋白的功能。不同酵母菌种体内铁含量的测定结果表明,转化的突变体其体内铁含量高于突变体,说明IRT转运蛋白确实对转运铁离子起到很大作用。 根据IRT结构分析,推断该转运蛋白是一种膜蛋白,为进一步确认它的亚细胞定位,利用GFP(绿色荧光蛋白),构建了pDBLeu-IRT::GFP融合基因的酵母表达载体,转化酵母,筛选阳性克隆,然后在荧光显微镜和共聚焦激光显微镜下观察,可以看到很明显的荧光,说明GFP已经成功表达,而且在共聚焦激光显微镜下细胞不同切面荧光强弱不同,初步推断IRT定位在质膜上。
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