论文部分内容阅读
癌症作为威胁人们健康和幸福的最主要原因之一,如果早期诊断和干预不能实现,后续的治疗或维持都将面临极大困难。准确测定血清肿瘤标志物有助于提高癌症的诊断率,并兼具监测药物治疗或手术预后效果的作用。免疫分析已被证明是测定微量肿瘤标志物的理想方法,这主要得益于抗原-抗体免疫复合物形成过程中高度的反应性和特异性。目前,磁性聚合物微球逐渐取代了传统免疫分析中所使用的平面载体。然而,磁性聚合物微球普遍存在磁响应性较差、包覆层不均匀、比表面积较小、非特异性吸附较强等问题,并且未能解决传统免疫分析中存在的高背景值、清洗不便、耗时较长等问题。磁性微纳材料通常是指一类兼具微纳特性和磁响应性的材料,其比表面积更大、磁响应性更强,有望应用于免疫分析并替代磁性聚合物微球。本文首先研究了磁性微纳材料对于化学发光免疫分析体系的影响,进而开发了基于磁性微纳材料的化学发光免疫分析方法。针对现行免疫分析技术所存在的一些问题,制备并修饰了多种新型磁性微纳材料,提出了免清洗、无标记等新型免疫分析方案,并对方案的机理、影响因素及其应用性能进行了研究。微纳颗粒表面不均匀的包覆层可能导致其内容物的暴露。由此,本文建立了一个模拟系统,使用裸露的Fe3O4磁性微纳颗粒来研究暴露的情况在化学发光免疫分析中的影响。研究了一些因素,如磁性微纳颗粒的浓度,辣根过氧化物酶(HRP)的共存,不同的粒径和各种处理方法。证实了微纳颗粒本体和所暴露的金属氧化物表面都与检测信号息息相关。该结论能够为化学发光免疫分析中出现的测定偏差提供一种新的解释。开发了基于Fe3O4磁性亚微米颗粒的化学发光免疫分析体系并应用于对人绒毛膜促性腺激素(HCG)的测定。用抗α-HCG抗体修饰羧基官能化的磁性亚微米颗粒,并进一步用作夹心型免疫分析中的固相支持物。在最佳条件下HCG的检出限低至1.184 ng/mL,线性响应范围为2-100 ng/mL,相关系数为0.989。同时该方法可用于血清样品中的HCG测定,初步验证了其在快速经济地检测生物样品中的应用潜力。设计了一种新型的化学发光(CL)免清洗免疫传感器,用于以人甲胎蛋白(AFP)为代表的肿瘤标志物的化学发光免疫分析。首先在溶剂热法所制备的Fe3O4磁性亚微米颗粒的表面引发了活性功能基团。借助活性功能基团偶联双功能聚乙二醇间隔臂分子以降低颗粒表面的非特定吸附能力,并通过间隔臂分子进一步将N-(4-氨基己基)-N-乙基异鲁米诺(AHEI)和抗AFP抗体固定在颗粒表面。通过与AFP和辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗AFP抗体分别孵育后,颗粒表面所形成的夹心型免疫复合物可导致AHEI和HRP之间的紧密接近,从而最终导致检测到的CL信号的增强。由于被结合的HRP标记的抗AFP抗体产生比未被结合的酶标抗体更强的CL信号,这种方法消除了这种测定通常需要的耗费时间和劳力的清洗步骤。在最佳条件下,本方法显示出1-250ng/mL的广域定量范围,检测限为1.751 ng/mL。检测限能够满足生理(0-20 ng/mL)和临床(>20 ng/mL)AFP水平的测定需要。该方法也可以应用于血清样品中,同时还避免了由多次分离和清洗步骤引起的颗粒聚集的问题。报道了一种针对妊娠标志物HCG的无标记比色免疫分析方法。该分析是基于使用MnO2纳米棒作为过氧化物酶模拟物。以EDTA为模板,采用水热法制备了纳米棒。它们表现出优异的过氧化物酶样活性和稳定性。将纳米棒固定在BSA修饰的微孔板的孔中的壳聚糖基质中,然后用链霉亲和素和生物素化的捕获抗体对其进一步修饰。HCG和孔中抗体之间的特异性识别抑制了纳米棒的过氧化物酶样活性。因此,底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺被H2O2催化氧化形成蓝色产物的效率大打折扣。这导致652nm处的吸光度降低。信号响应在0.5-400 mIU mL的HCG浓度范围内呈线性,在优化条件下检出限为0.36 mIU/mL。该方法具有高度的特异性、可接受的重现性和稳定性。将其应用于血清中HCG浓度的测定,结果与参考方法所得数据吻合较好。