目的：乳腺癌是威胁当代女性生命健康最主要的恶性肿瘤之一，2007年卫生部调查统计显示其临床发病率为我国女性所患恶性肿瘤之首。据统计全球乳腺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，而其发病机制至今仍未完全阐明。针对这一严峻形势，探索新的乳腺癌治疗思路，寻找更为有效的治疗靶点仍然是乳腺癌治疗领域的研究热点。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）家族属于受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）家族，是与乳腺癌关系最为密切的一类生长因子受体，包括erbB-1/EGFR、erbB-2/HER2、erbB-3/HER3和erbB-4/HER4四大成员。受体与其相应配体结合导致受体上的酪氨酸磷酸化，通过信号转导参与调节细胞的增殖、分化及运动等，在正常乳腺的发育、成熟、退化过程中发挥着重要作用。四种受体在乳腺癌细胞通常呈现过表达。许多研究资料证实HER-2阳性是乳腺癌患者预后不良的一大主因，而EGFR过表达也是乳腺癌患者预后的不利标志，但尚未发现ErbB-3、ErbB-4过表达对乳腺癌预后的显著影响。虽然针对EGFR、HER-2的分子靶向药物西妥昔单抗（cetuximab）、曲妥珠单抗（trastuzumab）以及拉帕替尼（lapatinib）等均已应用于乳腺癌的临床治疗，但有效率不高，且伴有耐药问题，故开发更有效的抗EGFR及抗HER-2药物势在必行。细丝蛋白A（filamin a，FLNa）是一种肌动蛋白结合蛋白（actin bindingprotein，ABP），其分子可交联肌动蛋白丝形成稳定的细胞骨架，并与多种细胞膜蛋白结合，参与细胞增殖、粘附、迁移、侵袭等多种行为。FLNa还干预细胞内多种受体的表达，从而影响多条信号转导通路，参与肿瘤的发生与发展。已有研究显示FLNa在肺癌、转移性乳腺癌、低分化星形细胞瘤、前列腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤中的表达均增多。并有研究显示FLNa的表达量与乳腺癌的恶性程度密切相关，但详细机制仍不清楚。FLNa是否对乳腺癌细胞EGFR、HER-2的活化有影响，目前尚未见相关报道。本研究拟通过：（1）采用Western blot检测不同乳腺癌细胞株中FLNa、EGFR、HER-2蛋白表达情况；（2）采用MTT、流式及划痕修复实验检测不同乳腺癌细胞的增殖及迁移能力；（3）质粒转染技术敲低或增加FLNa的表达后，观察乳腺癌细胞增殖能力、EGFR、HER-2酪氨酸磷酸化水平及其下游信号通路分子的变化。旨在从细胞、分子水平上分析FLNa对乳腺癌细胞增殖、迁移的影响，及其对表皮生长因子受体磷酸化及相应信号通路的调控作用，为更有效治疗乳腺癌寻找新靶点。方法：1Western blot检测不同乳腺癌细胞蛋白表达情况培养人乳腺癌MDA-MB-436细胞、MDA-MB-231细胞及SKBR-3细胞，收集细胞提取蛋白后进行Western blot，依次检测各种细胞中FLNa、EGFR、HER-2的蛋白表达情况。2MTT比色分析法检测不同乳腺癌细胞的增殖能力将上述3种乳腺癌细胞消化计数后接种至96孔板，采用MTT法检测EGF（20nM）刺激24h后每种细胞的增殖能力。3流式细胞术检测不同乳腺癌细胞的细胞周期分布情况培养乳腺癌细胞48h后收集细胞，以70%乙醇4℃固定过夜，应用流式细胞仪（flow cytometry，FCM）检测3种乳腺癌细胞的细胞周期分布情况。4划痕修复实验观察不同乳腺癌细胞的迁移能力培养乳腺癌细胞，待细胞贴壁融合达90%以上进行划痕，分别于划痕后0h、6h、12h用倒置显微镜观察并拍照，利用软件测量划痕宽度变化。5质粒转染后MTT比色分析法检测细胞增殖能力选取人乳腺癌MDA-MB-436细胞（高表达FLNa）、SKBR-3细胞（低表达FLNa）进行质粒转染，敲低或增加细胞内FLNa的表达后，MTT比色法观察不同浓度EGF（4nM、20nM、100nM）刺激24h后细胞的增殖情况。6激光共聚焦显微镜观察乳腺癌细胞内FLNa、EGFR、HER-2的定位培养MDA-MB-436细胞及SKBR-3细胞，用抗FLNa和抗EGFR的抗体，或抗FLNa和抗HER-2的抗体，及相应荧光二抗进行免疫细胞荧光染色，用激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）分别观察FLNa与EGFR、FLNa与HER-2的定位情况。7质粒转染后Western blot检测细胞内蛋白表达情况将表达FLNa-siRNA的质粒转染人乳腺癌MDA-MB-436细胞沉默其FLNa的表达，将表达FLNa全长的质粒转染SKBR-3细胞增加其FLNa的表达后，分别进行质粒转染，沉默或增加FLNa的表达后，利用westernblot检测经EGF（20nM）刺激0min、5min、10min、30min后细胞内p-EGFR、EGFR、p-HER、HER、p-ERK及ERK的表达情况。结果：1不同乳腺癌细胞的蛋白表达及增殖、迁移能力的比较1.1不同乳腺癌细胞蛋白表达情况的比较应用ImageJ软件对蛋白条带进行扫描分析，人乳腺癌MDA-MB-436、MDA-MB-231细胞之间FLNa（0.20±0.01，0.19±0.00）、EGFR（0.41±0.02，0.40±0.01）、HER-2（0.02±0.00，0.02±0.00）蛋白的表达均无明显差异，SKBR-3细胞FLNa（0.08±0.00）蛋白的表达明显低于MDA-MB-436、MDA-MB-231细胞，差异有显著性（P＜0.01），EGFR、HER-2蛋白在SKBR-3细胞中的表达（0.48±0.03）、（0.12±0.03）明显高于MDA-MB-436、MDA-MB-231细胞，差异具有统计学意义（P＜0.01）。1.2不同乳腺癌细胞增殖能力的比较利用MTT比色分析法测定各孔的OD值，按照以下公式计算EGF刺激后细胞增长率：增长率=（实验组OD值-对照组OD值）/对照组OD值×100%。MDA-MB-436、MDA-MB-231细胞之间进行比较增长率（30.35±9.18%，31.71±2.87%）无明显差异，二者均高于SKBR-3细胞（8.13±2.61%），差异有统计学意义（P＜0.01）。1.3不同乳腺癌细胞细胞周期分布的比较采用流式细胞术检测不同乳腺癌细胞的细胞周期分布，按照以下公式计算细胞增殖指数：增殖指数=（S+G2M）/（G0/1+S+G2M）×100%。MDA-MB-436细胞与MDA-MB-231细胞之间增殖指数（57.03±2.63%，52.97±3.58%）无统计学差异，而SKBR-3细胞的增殖指数（30.30±0.56%）明显低于以上两组，有统计学差异（P＜0.01）。1.4不同乳腺癌细胞迁移能力的比较利用相应软件测量划痕宽度，按以下公式计算细胞迁移率：细胞迁移率=（划痕初始宽度-划痕目前宽度）/2/划痕初始宽度×100%。MDA-MB-436细胞在划痕后6h、12h的迁移率（15.22±4.18%，31.82±3.36%）与MDA-MB-231细胞（14.84±2.96%，29.12±5.65%）比较均无统计学差异，而SKBR-3细胞的迁移率（1.70±0.94%，2.78±1.20%）明显低于MDA-MB-436细胞和MDA-MB-231细胞，差异有显著性（P＜0.01）。2质粒转染后乳腺癌细胞增殖能力的比较质粒转染后MTT法检测各孔的OD值进行统计分析，经EGF（4nM、20nM、100nM）刺激后MDA-MB-436细胞FLNa-siRNA转染组的增殖能力（1.00±0.10，1.18±0.25，1.28±0.16）较阴性对照转染组（1.38±0.19，1.60±0.20，1.73±0.20）显著降低，SKBR-3细胞FLNa全长质粒转染组的增殖能力（1.19±0.20，1.36±0.20，1.59±0.13）明显高于阴性对照转染组（0.87±0.16，1.00±0.19，1.26±0.14），差异均有统计学意义（P＜0.05）。3FLNa作用机制探讨3.1FLNa与EGFR、HER-2在细胞内的定位免疫细胞荧光染色后经激光共聚焦显微镜观察发现：在乳腺癌MDA-MB-436细胞中，FLNa主要存在于细胞浆及细胞膜， EGFR主要存在于细胞膜，二者共定位于细胞膜上。而在SKBR-3细胞中，FLNa与EGFR及FLNa与HER-2存在并共定位于细胞膜。3.2沉默FLNa表达对MDA-MB-436细胞EGFR活化的影响将FLNa-siRNA质粒转染MDA-MB-436细胞，Western blot检测EGF刺激0min、5min、10min、30min后蛋白表达情况。结果显示，FLNa-siRNA转染组各时间点FLNa蛋白的表达（0.43±0.07，0.52±0.03，0.49±0.05，0.26±0.03）均较阴性对照转染组（0.93±0.11，1.08±0.20，1.18±0.20，0.89±0.13）明显降低，有统计学差异（P＜0.01或P＜0.05），FLNa-siRNA转染组EGFR磷酸化水平（0.81±0.04，0.80±0.02，0.14±0.01）及ERK磷酸化水平（0.71±0.17，0.77±0.03，0.81±0.02）于5min、10min、30min均低于阴性对照转染组（1.01±0.02，1.22±0.12，0.68±0.04）、（1.61±0.07，1.67±0.22，1.17±0.10），差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。3.3增加FLNa表达对SKBR-3细胞表皮生长因子受体活化的影响将FLNa全长质粒转染SKBR-3细胞，Westernblot检测EGF刺激0min、5min、10min、30min后蛋白表达情况。结果显示，FLNa转染组各时间点FLNa蛋白的表达（1.05±0.10，1.20±0.05，1.04±0.09，1.34±0.03）均较阴性对照转染组（0.62±0.01，0.82±0.08，0.58±0.02，0.44±0.01）明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。FLNa转染组EGFR（0.95±0.10，0.74±0.02，0.38±0.09）、HER-2（1.17±0.12，1.29±0.15，2.20±0.23）、ERK（1.49±0.05，1.41±0.07，1.41±0.02）三种蛋白的磷酸化水平于5min、10min、30min均高于阴性对照转染组（0.73±0.06，0.41±0.01，0.20±0.02）、（0.79±0.09，0.83±0.04，1.65±0.14）、（1.32±0.06，1.06±0.08，0.80±0.05），差异有显著性（P＜0.01或P＜0.05）。结论：1乳腺癌细胞的增殖、迁移能力与FLNa表达水平密切相关，沉默FLNa的表达可降低乳腺癌细胞的增殖能力，使FLNa过表达则细胞的增殖能力增强，表明FLNa对乳腺癌细胞的增殖具有促进作用。2乳腺癌细胞内EGFR、HER-2蛋白的表达量不是评价乳腺癌预后的决定性因素，受体的活化程度才是影响乳腺癌发展的关键。FLNa通过影响乳腺癌细胞EGFR、HER-2的磷酸化，调控其所介导的Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路，进而影响乳腺癌细胞的增殖。