论文部分内容阅读
衰老过程中骨骼肌会出现增龄性骨骼肌萎缩变化。在以往的研究中,无论是衰老骨骼肌退行性变化的研究,还是运动与限食作为干预减缓增龄性骨骼肌退变的研究,大多集中在肌肉的合成方面。在最近几年人们逐渐意识到降解对骨骼肌功能和质量的重要性,研究方向逐渐转向骨骼肌的降解。体内80%的蛋白是由泛素-蛋白酶体系统负责降解的,所以体内蛋白的泛素化修饰水平对于蛋白的质量控制至关重要。研究目的:本实验从泛素化修饰水平角度展开研究,通过非标定量和泛素化修饰富集技术以及高分辨率液相色谱-质谱联用的定量蛋白质组学研究策略,探索泛素化修饰水平的变化与衰老进程的关系,且使用限食与运动作为干预手段,探索运动与限食对于衰老机体中蛋白泛素化修饰水平的影响。实验动物选取:本实验选取9月龄体重无明显差异的雄性SD大鼠40只(购于天津市奥易实验动物养殖有限公司,许可号:SCXK(京)2007-0003,级别VAF)。首先随机选取8只大鼠作为青年对照组(n=8),进行取材。其余大鼠(n=32)继续在本实验室动物房内饲养,直到大鼠月龄为24月龄时,开始我们的实验干预。动物模型构建:所购大鼠在本实验室动物房内饲养,动物房为清洁级实验动物房。每笼2只,自然采光,自然昼夜节律,自由摄食,室内温度20-25℃,湿度40%-60%。训练方案:本研究根据Zsolt Radak报道过的方法进行试验:模式动物分组:待SD大鼠饲养至24月龄,衰老大鼠(n=32)随机分成四组分别是:正常饮食安静对照组(S,本文简称衰老组),热量摄入限制组(X,本文简称限食组),运动干预组(Y,本文简称运动组),热量限制加运动组(YX,本文简称运动限食组)。运动干预:本实验在一周适应性运动后,每周六天进行同等强度的跑台训练,强度15m/min,45 min/次,为期三个月。限食干预:采用单笼喂养,自由饮水,限食组与运动限食组大鼠食物摄入量为自由摄食时的60%,非限食组投放充足的饲料。实验方法及步骤:在动物模型构筑成功后,进行取材,蛋白提取,蛋白浓度测定,SDS-PAGE,胰酶酶解,修饰富集,液相色谱-质谱联用分析,数据库搜索,KEGG蛋白通路注释,亚细胞定位。统计学分析:双样本双尾T检验计算组间p值。设p值<0.05时为显著差异,且差异修饰量变化超过1.5作为显著上调的变化阈值,小于1/1.5作为显著下调的变化阈值。实验结果:1.通过质谱分析共得到255754张二级谱图。质谱二级谱图经蛋白理论数据搜库后,得到可利用有效谱图数为70009,谱图利用率为27.4%,通过谱图解析共鉴定到6316条肽段,2646个泛素化修饰肽段。我们一共鉴定到870.0个蛋白上的2730.0个泛素化修饰位点,其中757.0个蛋白上的2392.0个位点具有定量信息。2.在衰老与青年组比较组中,泛素化修饰水平显著上调的蛋白有33个,位点为65个。泛素化修饰水平显著下调的蛋白有114个,位点有233个。在限食组与衰老组比较组中,泛素化修饰水平显著上调的蛋白有103个,位点为229个。泛素化修饰水平显著下调的蛋白有15个,位点有21个。在运动组与衰老组比较组中,泛素化修饰水平显著上调的蛋白有43个,位点为82个。泛素化修饰水平显著下调的蛋白有31个,位点有55个。在运动限食组与衰老组比较组中,泛素化修饰水平显著上调的蛋白有138个,位点为344个。泛素化修饰水平显著下调的蛋白有8个,位点有10个。3.通过KEGG数据库富集得到的通路。衰老组与青年组比较组:代谢通路:Glycolysis/Gluconeogenesis,Citrate cycle(TCA cycle),Pentose phosphate通路,Fructose and mannose代谢,Oxidative phosphorylation等;信号途径:Glucagon信号通路;与该比较组中代谢通路与信号通路高度相关的通路有:Thyroid hormone synthesis,阿尔茨海默病,帕金森病等。限食组与衰老组比较组:代谢通路:Glycolysis/Gluconeogenesis,Citrate cycle(TCA cycle),Fructose and mannose metabolism,Oxidative phosphorylation,Metabolic通路等;信号通路:Calcium信号通路,cGMP-PKG信号通路,Apelin信号通路;与该比较组中代谢通路与信号通路高度相关的通路:亨廷顿病,Legionellosis,Circadian entrainment等。运动组与衰老组比较组:代谢通路:Arginine生物合成,Tyrosine代谢,Phenylalanine代谢等;信号通路:Calcium信号通路,cGMP-PKG信号通路;与该比较组中代谢通路与信号通路高度相关的通路有:Estrogen信号通路,Thyroid hormone信号通路,亨廷顿病等。运动限食组与衰老组比较组:代谢通路:Glycolysis/Gluconeogenesis,Citrate cycle(TCA cycle),Purine代谢等;信号通路:Calcium信号通路,cGMP-PKG信号通路,cAMP信号通路;与该比较组中代谢通路与信号通路高度相关的通路有:Adrenergic signaling in cardiomyocytes,昼夜节律,Insulin secretion,Glucagon信号通路等。运动限食组与限食组比较组:代谢通路:Glycolysis/Gluconeogenesis,Glutathione代谢,Carbon代谢;信号通路:PPAR信号通路,Calcium信号通路,cGMP-PKG信号通路等;与该比较组中代谢通路与信号通路高度相关的通路有:阿尔茨海默病。运动限食组与运动组比较组:代谢通路:Glycolysis/Gluconeogenesis,Citrate cycle(TCA cycle),Oxidative phosphorylation,Pyruvate代谢,Carbon代谢等;信号通路:Calcium信号通路,cGMP-PKG信号通路,cAMP信号通路;与该比较组中代谢通路与信号通路高度相关的通路有:Thyroid hormone信号通路,唾液分泌,胆汁分泌等。4.使用KEGG通路数据库对衰老组与青年组比较组,限食组与衰老组,运动组与衰老组比较组,运动限食组与衰老组比较组中均出现泛素化修饰水平显著差异的蛋白进行蛋白通路注释,得到多条蛋白通路,其中TCA循环通路具有显著的泛素化修饰水平变化一致性。5.Malate dehydrogenase,cytoplasmic蛋白相对表达量显著性:与衰老组相比,青年组中该蛋白相对表达量显著降低(p<0.01),限食组该蛋白相对相对表达量无显著差异,运动限食组该蛋白相对表达量显著降低(p<0.05)。Malate dehydrogenase,mitochondrial蛋白相对表达量显著性:与衰老组相比,青年组中该蛋白相对表达量无显著变化,限食组该蛋白相对表达量显著降低(p<0.05),运动限食组该蛋白相对表达量无显著变化。Isocitrate dehydrogenase[NADP],mitochondrial蛋白相对表达量显著性:与衰老组相比,青年组中该蛋白相对表达量显著下降(p<0.01),限食组该蛋白相对表达量显著升高(p<0.01),运动限食组该蛋白相对表达量无显著变化。Isocitrate dehydrogenase[NAD]subunit,mitochondrial蛋白相对表达量显著性:与衰老组相比,青年组中该蛋白相对表达量显著上升(p<0.05),限食组该蛋白相对表达量无显著差异,运动限食组该蛋白相对表达量无显著差异。Isocitrate dehydrogenase[NAD]subunit beta,mitochondrial蛋白相对表达量显著性:与衰老组相比,青年组中该蛋白相对表达量显著上升(p<0.01),限食组该蛋白相对表达量显著上升(p<0.01),运动限食组该蛋白相对表达量显著上升(p<0.01)。Dihydrolipoamide S-succinyltransferase(E2 component of2-oxo-glutarate complex)蛋白相对表达量显著性:与衰老组相比,青年组中该蛋白相对表达量无显著差异,限食组该蛋白相对表达量显著上升(p<0.01),运动限食组该蛋白相对表达量显著上升(p<0.05)。Aconitate hydratase,mitochondrial蛋白相对表达量显著性:与衰老组相比,青年组中该蛋白相对表达量显著降低(p<0.05),限食组该蛋白相对表达量与运动限食组该蛋白相对表达量无显著差异。6.泛素化修饰水平存在显著差异的蛋白中,定位到线粒体的蛋白有30个(附录),其中,在衰老组与青年组比较组,限食组与衰老组比较组,运动组与衰老组比较组,运动限食组与衰老组比较组中均出现泛素化修饰水平显著差异的蛋白有ADP/ATP translocase 1。结论:在衰老机体中,骨骼肌蛋白泛素化修饰水平整体下降,这可能提示骨骼肌衰老表现与蛋白泛素化降解有密切关系。限食与运动可以恢复或提高骨骼肌蛋白的泛素化修饰水平。为进一步验证可能的蛋白泛素化修饰水平对骨骼肌增龄性变化的影响机制,以及运动与限食提高骨骼肌蛋白泛素化修饰水平的可能机制,对泛素化修饰差异蛋白做蛋白通路注释。在得到的多条蛋白通路中,TCA循环泛素化修饰水平变化一致性显著,因此推测TCA循环可能是造成衰老表现的关键机制,或运动与限食干预抵御骨骼肌衰老表现的关键机制。运动与限食可以提高TCA循环通路中蛋白的泛素化修饰水平,推测可提高通路中蛋白的更新率。如果通路中蛋白的更新率提高,则可以增强衰老骨骼肌中TCA循环通路的通路活性和功能水平,一定程度上恢复衰老骨骼肌的有氧氧化功能,甚至抵御骨骼肌由于衰老所造成的损伤。根据找出的骨骼肌增龄性变化可能的关键蛋白通路(TCA循环),以及为进一步研究线粒体相关蛋白泛素化修饰水平变化对骨骼肌增龄性变化的影响,对所有泛素化差异蛋白进行亚细胞结构定位,发现与衰老组相比,ADP/ATP translocase 1在运动组,限食组,运动限食组,衰老组中都有显著性变化。推测ADP/ATP translocase 1可能为衰老过程中,造成骨骼肌衰老表现的相关线粒体机制的关键蛋白,以及运动与限食干预延缓骨骼肌衰老的靶点。推测运动与限食干预可以提高ADP/ATP translocase 1的更新率。