酿酒酵母生长相关基因的组合删除及对生长的影响

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酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia)是存在于自然界中的一种单细胞真核生物,其细胞结构与植物、动物细胞结构相似,生活周期短,遗传背景清晰,常作为真核生物研究的模式生物。传统酿酒酵母研究集中在食品、饮料、药品等工业方面的应用。现阶段,关于酿酒酵母的研究更多的是分子水平的研究:一方面,通过单基因或多基因敲除研究酿酒酵母基因的功能,并根据其与高等动物基因的高度同源性,了解人类基因的功能。另一方面,通过改良酿酒酵母基因组,获得高效表达的人类所需产品的工程菌,例如人胰岛素、谷胱甘肽、青蒿素等生产菌株。其中S288C株系已完成了全基因组的测序,并且建立了基因组文库等多种分子遗传手段,已经成为生物学界中研究高等真核生物生命过程各个细节的关键点和突破口。  本研究首先通过检索酿酒酵母基因组数据库,筛选出15株与生长相关的单基因缺失的单倍体菌株。HO质粒上的HO基因编码的位点特异性重组酶能够使酵母菌的交配型发生转换,将HO质粒分别导入菌株后,就会产生不同交配型的后代,不同交配型的酵母细胞接合即可形成二倍体。二倍体细胞具有产孢能力,可以产生不同交配型的孢子,不同交配型单倍体细胞之间相互交配又可形成二倍体。利用酿酒酵母的这一繁殖特性,对这15个基因进行筛选。筛选标准的是YPD平板上具有生长优势的较大的菌落,目的是从这15个基因中筛选出对菌株的生长优势贡献最大的一个或几个基因。  在研究的中期阶段,获得了3株具有生长优势的菌株,但是发现它们的基因型都不稳定,且均出现生长优势退化的现象。由于酿酒酵母自身同源重组效率较高的特性,而我们的出发菌株均为G418抗性盒子替换敲除基因的缺失菌株,所以可能是由于不同抗性盒子之间的同源重组造成了基因型的不稳定和和生长优势性状退化现象。  为了获得一株基因型稳定、生长具有优势的菌株,对之前筛选出的所有优势菌株中出现频率较高的GOR1、RPI1、DPL1三个基因,利用Cre/LoxP敲除系统从野生型菌株中做组合删除,得到7株基因缺失菌株。然后对这7株菌的生长情况的做研究分析,包括生长曲线、高温耐受、营养饥饿耐受、渗透压耐受、酒精耐受的梯度生长情况研究。各菌株生长情况各有不同,对各种极性环境的耐受程度表现也各有不同。
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