器官移植被公认为是能治愈大多数终末期实质性脏器疾病的唯一有效治疗方法，近几十年来，免疫抑制药物的进步和对移植后排斥反应的相关免疫学机理的研究，使得器官移植治疗取得了长足的进步。移植后排斥反应的发生已因为免疫抑制剂药物的改进和治疗经验的积累而有所减少，但依然是导致同种异体器官移植后移植物失功能的最重要的原因之一。特别是急性排斥反应，发生的时间窗一般为术后几个月内，不能及时治疗会对移植器官造成严重的损害甚至是失功能。在临床上，由于症状的表现形式相近，急性排斥反应经常与感染、保存性损伤等移植后常见并发症难以鉴别，这些并发症有各自发病的机理，在治疗上也存在着相互冲突的地方。比如治疗急性排斥反应时采取的大剂量激素冲击治疗，就会诱发感染或使感染加重。急性排斥反应的治疗刻不容缓，因此准确快速的急性排斥反应诊断方法十分重要。临床上一般是出现临床症状后，对移植器官进行活组织病理检查，这是目前临床普遍公认的金标准，但活组织检查是有创检查，会对移植脏器造成伤害甚至引起严重的临床并发症，肝穿刺有可能造成出血，感染等情况，对于移植后免疫抑制状态下的机体来说，这些并发症可能就是致命的。为了评估排斥反应治疗后的转归情况，还可能进行多次活组织病理检查，加大了并发症发生的风险。以往的研究尝试应用影像学、血清学和免疫学指标等无创手段来诊断急性排斥反应，例如应用心血管核磁共振诊断心脏移植后排斥反应，多普勒超声检查阻力指数(RI)来诊断急性肾排斥反应，虽然有一定的敏感性，但特异性不强；有用胆道细胞学来诊断肝移植后排斥反应，但不能与保存性损伤及胆道并发症做出很好的鉴别；有用IL-2R作为指标来诊断急性排斥反应，但其在T细胞活化前后都有表达，并是调节性T细胞的标志之一，无法特异性进行诊断。研究一种有效的代替活组织病理检查的无创检查手段来诊断和跟踪治疗急性排斥反应对于临床器官移植治疗是十分有益的工作，具有重要的科学意义及应用价值。　　 同种异体器官排斥反应的机制复杂，导致其发生的根本原因是供受体双方的遗传基因背景不同因此诱发的T细胞对同种抗原产生的免疫应答。移植物抗原主要是MHC基因编码的两类蛋白分子，Ⅱ类基因编码的Ⅱ类抗原与HLAⅠ类基因编码的Ⅰ类抗原，还有一些非经典的MHC分子和次要组织相容性抗原分子。在急性排斥反应的早期，其主要机制是供体的树突状细胞(dendriticcellDC)、巨噬细胞(macrophageMφ)等抗原递呈细胞(antigen-preseentingcellAPC)加工处理来自受体的移植抗原，形成抗原肽/MHCⅡ分子复合物递呈给供体CD4+T细胞，同时提供协同刺激分子成为第二信号，启动CD4+T细胞内活化信号，激活胞内一系列酪氨酸(PTK)及多种细胞因子的表达，从而推动细胞的分化、增殖；急性排斥反应的晚期主要机制为受体APC将吞噬、加工、处理形成供体抗原肽/MHCⅡ分子复合物递呈给受体CD4+T细胞，激活介导移植排斥反应。　　 T细胞要发挥效应除了需要特异性抗原信号作用于T细胞受体(TCR)外，还需要APC提供共刺激信号。原型共刺激分子CD28可诱导产生一系列细胞效应因子，但CD28缺失的小鼠依旧可以发生急性心脏移植物排斥反应，提示体内还有另外一种关键的共刺激分子存在。　　 德国学者Hutloff在1999年在实验中用活化的人T细胞免疫小鼠获得一株单克隆抗体F44，该抗体识别的抗原是一种表达在活化后的T细胞表面的新分子，因可引起T细胞的再次活化，所以命名为可诱导共刺激分子(inducibleco-stimulatorICOS)，属于CD28家族的新成员。　　 ICOS的特点是表达在活化的T细胞表面，而T细胞的活化在T细胞引起的免疫应答中初始阶段和反应阶段都是必不可少的。因此我们推断反映ICOS在体内实时表达程度能反映体内T细胞活化介导免疫应答的程度，从而间接的反映体内急性排斥反应的程度。　　 Fluobeam(R)开放式实时成像系统是基于近红外成像原理，利用近红外光较深的组织穿透性，可以检测更深、更小的目标，克服细胞和组织自发荧光干扰、选择性吸收等弊端，配合近红外荧光染料，提供更高的特异性和灵敏度。该成像系统广泛应用于肿瘤研究，心血管研究，药物示踪和疗效评估等方面。　　 应用荧光标记物Cy7.SE标记anti-ICOS，在不同时间点注射到移植后动物模型，应用Fluobeam(R)开放式实时成像系统观察荧光图像，分析荧光强弱变化，同时分析T细胞的ICOS表达及移植物病理情况，反映荧光图像、ICOS表达情况和病理结果的同步相关性，从而为荧光标记anti-ICOS检测的移植物荧光显像反映急性排斥反应提供实验数据和研究依据。　　 第一部分，T细胞活化前后ICOS分子在T细胞表面表达趋势的研究　　 目的：本实验通过应用抗CD3、CD28抗体体外激活T细胞，分析ICOS在T细胞活化前后的表达异同及随时间变化的表达趋势。　　 方法：把从C57BL/6小鼠(H-2b)小鼠脾脏收集的T细胞分为未活化对照组，刺激活化组。在细胞培养4h、8h、16h、32h、64h时分别进行RT-PCR检测T细胞ICOSmRNA的表达情况和流式细胞仪检测T细胞表面表达ICOS的表达情况。　　 结果：RT-PCR检测4h时T细胞ICOSmRNA在刺激活化组与对照组的表达没有明显区别(p>0.05)，而8、16、32、64h时T细胞ICOSmRNA在刺激活化组与对照组的表达有明显区别，刺激活化组明显高于对照组(p<0.05)；对照组T细胞ICOSmRNA在各时间点基本不表达，刺激活化组T细胞ICOSmRNA的表达随时间延长而增加，到32h后表达到高峰。流式细胞仪检测4h时T细胞ICOS的表达在刺激活化组与对照组没有明显区别(p>0.05)，而8、16、32、64h时T细胞ICOS在刺激活化组与对照组的表达有明显区别，刺激活化组明显高于对照组(p<0.05)；对照组T细胞ICOS在各时间点基本不表达，刺激活化组T细胞ICOS的表达随时间延长而增加，到32h后表达到高峰。　　 结论：T细胞活化后ICOS表达显著增加，而未活化T细胞基本不表达ICOS，提示ICOS的表达可作为T细胞活化的标志在检测中应用。　　 第二部分，改进Cuff技术建立小鼠颈部异位心脏移植模型的探索　　 目的：探索建立有简便、成功率高的小鼠颈部异位心脏移植模型。　　 方法：采用受体准备-供心制备-血管吻合的操作顺序，供心制备时采取胸腔内整体脏器切取，迅速降温减少热缺血时间，受体吻合血管处理时灵活运用器械和预置结扎线，方便单人独立完成模型手术。　　 结果：模型总成功率为83％。受体准备时间平均为14.7±2.6min，供心制备时间平均为12.4±2.8min，心脏移植时间平均为7.7±1.4min。同系间移植成功的供体心脏可以长期存活(超过3个月)。同种间移植成功的供体心脏，因发生排斥反应，移植心脏存活时间为7.5±2.1天。　　 结论：改进的Cuff技术小鼠颈部异位心脏移植模型具有简便、成功率高等优势，为进一步开展基于该模型的研究奠定基础。　　 第三部分，荧光标记anti-ICOS的荧光示踪技术诊断小鼠心脏移植急性排斥反应的研究　　 目的：应用荧光标记物Cy7.SE标记anti-ICOS，注射到移植后动物模型，应用Fluobeam(R)开放式实时成像系统观察移植物荧光图像，分析荧光强弱变化，同时分析受体脾脏T细胞的ICOS表达及移植物病理情况，反映荧光图像、ICOS表达和病理结果的同步相关性，从而为荧光标记anti-ICOS的移植物荧光显像检测反映急性排斥反应提供实验数据和研究依据。　　 方法：实验分为4组，移植对照组：同系移植(isograft)，C57BL/6小鼠供体心移植到C57BL/6小鼠；移植排斥组：同种移植(allograft)，BALB/C小鼠供体心脏移植到C57BL/6小鼠受体，不予免疫抑制剂伺服；移植排斥治疗组：同种移植加用免疫抑制剂(allograft+tacrolimus)，BALB/C小鼠供体心脏移植到C57BL/6小鼠受体，术后受体他克莫司饲服(1.0mg/Kg.天)；移植排斥治疗停药组(allograft+tacrolimusceased)：BALB/C小鼠供体心脏移植到C57BL/6小鼠受体，术后受体连续他克莫司饲服(1.0mg/Kg.天)7天后停止使用免疫抑制剂。在1、3、5、7天对各组受体小鼠尾静脉注射Cy7.SE-anti-ICOS溶液0.2ml，5min后Fluobeam(R)开放式实时成像系统摄取图像，留取图像资料；术后1、3、5、7天取各组小鼠移植心脏做病理切片检查，同时应用RT-PCR和流式细胞仪检测小鼠体内的ICOS表达情况。　　 结果：Fluobeam(R)开放式实时成像系统摄取图像，图像显示移植对照组及移植排斥治疗组受体小鼠全身荧光显象不明显，移植排斥及停药组小鼠随着天数的增加，颈部异位移植心脏处荧光显像愈加明显。RT-PCR法检测T细胞ICOSmRNA的表达情况，结果显示第1天时小鼠脾脏内T细胞ICOSmRNA在4个组别的表达没有明显区别(p>0.05)，而第3、5、7天时T细胞ICOSmRNA在4个组别的表达有明显区别(p<0.05)，同种移植及停药组明显高于对照同系移植和同种移植加免疫抑制治疗组；同种移植及停药组小鼠T细胞ICOSmRNA随时间延长表达增加。流式细胞仪检测ICOS的表达情况，结果显示移植后第一天时T细胞ICOS在4个组别的表达没有明显区别(p>0.05)，而移植后第3、5、7天时T细胞ICOS表达在4个组别的表达有明显区别(p<0.05)，同种移植及停药组明显高于对照同系移植和同种移植加免疫抑制治疗组；同种移植及停药组小鼠T细胞ICOS随时间延长表达增加。病理提示在1、3、5、7天同系移植及同种移植加免疫抑制剂治疗组无明显排斥，而在同种移植及停药组有排斥反应现象，且随时间逐渐加重。　　 结论：用Cy7.SE标记anti-ICOS的方法应用成像系统观察小鼠移植心脏的排斥反应，其图像中移植物荧光的强度变化与脾脏T细胞ICOS表达及实际的病理演变相一致，提示应用荧光标记anti-ICOS的移植物荧光显像来检测急性排斥反应具有可行性，为其临床应用提供了有益的证据和支持。