【摘 要】
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从全世界范围来看,肝细胞肝癌（HCC）是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。然而乙型肝炎病毒（HBV）的感染是导致肝癌发生的最重要的因素之一。HBV导致肝癌发生发展机制很多,这包括其基因组整合进宿主基因组、诱导肝细胞的凋亡、参与细胞中一些重要信号通路的调控、以及介导肝癌细胞的侵袭与转移等。目前对于肝癌的治疗方法不断提高,但患者的预后效果并非理想。其不良预后以及高复发性在很大程度上是由于发生了肝内外的转
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从全世界范围来看,肝细胞肝癌（HCC）是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。然而乙型肝炎病毒（HBV）的感染是导致肝癌发生的最重要的因素之一。HBV导致肝癌发生发展机制很多,这包括其基因组整合进宿主基因组、诱导肝细胞的凋亡、参与细胞中一些重要信号通路的调控、以及介导肝癌细胞的侵袭与转移等。目前对于肝癌的治疗方法不断提高,但患者的预后效果并非理想。其不良预后以及高复发性在很大程度上是由于发生了肝内外的转移。转移是受多因素影响的一个复杂的过程,而HBV引发肝癌细胞发生转移的的分子机制仍然有许多未知。miRNA是一类仅有22nt左右个核苷酸组成且不能翻译为蛋白质的一类微小RNA。在生物体中,它可以参与细胞中多种生命活动,其作用的最主要的机制是在转录后水平上对与其互补的mRNA的调控。而关于HBV如何调控miRNA,及其在肝癌发生发展中的具体功能仍是科学家研究热点。本研究利用肝癌的组织芯片,筛选和鉴定出了 miR-520c-3p,发现其在HBV相关性的肝癌组织及肝癌细胞中存在高表达的现象,提示miR-520c-3p在肝癌发生发展中可能发挥重要的作用。在探索miR-520c-3p在肝癌发生发展中的功能时,本研究通过划痕实验,发现过表达miR-520c-3p可以促进肝癌细胞的迁移而敲低miR-520c-3p则抑制。同时通过对EMT（上皮-间质转型）中关键标志分子（E-cadherin、Vimentinn、MMP9）的蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测,发现miR-520c-3p的这种促迁移能力主要是通过介导EMT途径来实现的。而在Huh7细胞中,过表达HBV1.3的同时加入miR-520c-3p的抑制子,发现miR-520c-3p抑制子的加入同样削弱了 HBV的促迁移能力。在进一步探索HBV如何对miR-520c-3p进行调控时,本研究从HBV感染细胞后合成的几个病毒蛋白（Pol、Core、S、X蛋白）入手。在Huh7细胞中分别过表达这些蛋白,发现其中的X蛋白能明显地上调miR-520c-3p的表达。HBx调控基因的表达,通常通过其它转录因子发挥作用,为进一步探索HBx蛋白调控miR-520c-3p的表达,本研究选取了可能与HBx有结合作用,且在miR-520c-3p的启动子区域预测可能存在作用位点的转录因子CREB1（环磷酸腺苷应答元件结合蛋白1）、CREB2和P53进行验证,检测选取的转录因子是否对miR-520c-3p有调控作用。qPCR实验结果发现CREB1的调控作用最强。CREB1作为一个转录因子,对miR-520c-3p的调控作用极有可能是作用于其启动子区域。为证实这种猜想,本研究构建了 miR-520c-3p启动子区（-3887～+37）及其不同截短突变。双荧光实验证明CREB1对miR-520c-3p启动子区域-3887至-3110段发挥作用。接着探索HBx是否参与了其中的调控,本研究先后通过qPCR和ChIP实验进行了论证,得出X蛋白可以通过转录因子CREB1来介导miR-520c-3p的激活。在探索HBx和CREB1对miR-520c-3p调控的作用机制中,本研究想进一步探究这种调控作用是否在肝癌的转移中也发挥了重要的作用。首先在Huh7细胞中,过表达HBx蛋白的同时加入miR-520c-3p的抑制子,划痕实验和WB实验同时证明miR-520c-3p抑制子的加入逆转了 HBx通过EMT途径对肝癌细胞迁移的激活。接下来,在Huh7细胞中,过表达HBx时敲低掉CREB1,同时再过表达miR-520c-3p,检测EMT途径中的几个标志分子发现,HBx能通过CREB1上调miR-520c-3p的表达来激活EMT途径。综上所述,在HBV相关的肝癌组织以及肝癌细胞中,鉴定出miR-520c-3p的促癌功能,发现miR-520c-3p的促癌特性主要是通过HBV病毒的X蛋白介导EMT途径促进肝癌细胞的转移来实现的。miR-520c-3p在肝癌中的高表达主要由HBx通过转录因子CREB1,直接作用与其启动子区而实现。我们的课题阐明了HBV促肝癌转移的分子机制,为今后筛选治疗肝癌转移的靶点和药物提供有益的理论依据。
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