背景与目的β-地中海贫血与铁超载地中海贫血(thalassemia)简称地贫,又称珠蛋白合成障碍性贫血,是一种发病率较高的单基因遗传病。β-地贫是由于β-珠蛋白基因突变或缺失,引起p-珠蛋白链合成减少或缺失,相对过剩的α肽链形成包涵体沉积于细胞膜上,从而导致使红细胞寿命缩短并在脾脏内被大量破坏而引起溶血性贫血。β-地贫患者常伴严重的铁超载,原因包括：①慢性进行性溶血性贫血致血红蛋白铁释放；②重型β-地中海贫血患者长期输血治疗；③由于患者贫血,导致机体肠道铁吸收增加。铁超载是导致地贫患者脏器损伤以致死亡的主要原因,故防治铁超载是地贫治疗的重要措施。Hepcidin与铁代谢Hepcidin是2000年Krause等用质谱法从血浆超滤液中发现的小分子多肽,最初命名为肝表达的抗菌多肽(liver expressed antimicrobial peptide。LEAP-1)之后,Park等从尿液里也分离纯化出该多肽,正式命名为Hepcidin。人Hepcidin编码基因(HAMP)定位于19q13.1,长约2.5kb,含3个外显子和2个内含子,mRNA长度约0.4kb。Hepcidin主要由肝细胞合成,其作用靶点是膜铁转运蛋白(ferroportin, FP),而FP传递亚铁离子(Fe2+),是细胞内铁的运出者。当Hepcidin表达增加,其可与位于小肠粘膜上皮基底面和巨噬细胞、胎盘联合滋养细胞、肝细胞表面的FP结合,诱导FP降解,使细胞表面FP的数量减少,导致积聚在小肠粘膜上皮细胞、贮存在巨噬细胞等细胞内的铁不能释放进入血,血铁浓度降低；反之,当Hepcidin表达降低时,导致血铁浓度增高。因此,Hepcidin是调节体内铁稳态的关键物质。目前认为调控肝脏合成Hepcidin的途径有：铁储备；红细胞生成需求；炎症因子及信号途径等。Hepcidin与β-地中海贫血铁超载研究发现β-地贫患者不管是输血依赖还是非输血依赖都会发生铁超载,非输血依赖地贫患者铁负荷随年龄增长而增加,10年后也会达到重症患者需除铁治疗的水平。非输血依赖β-地贫患者铁负荷的主要原因是Hepcidin水平降低,因此提高Hepcidin水平,减少肠道对铁的吸收是除铁合剂外,减轻地贫患者铁负荷的另一条途径。寻找提高Hepcidin水平的药物对因Hepcidin水平降低而致铁负荷的疾病的治疗具有重要的临床意义。研究假设本课题组的前期系列研究发现黄芪是一种治疗β-地中海贫血患者的Y基因诱导剂,并鉴定出其有效成分为黄芪多糖(Astragalus Polydsaccharides, APS),而且发现APS的作用机制涉及激活p38MAPK信号通路。许多研究已证实p38MAPK信号通路对非特异性炎症反应中炎症细胞因子(如IL-1、IL-6和TNF-a)的生成具有重要的调控作用；而炎症细胞因子能通过激活蛋白质酪氨酸激酶／信号传导与转录激活因子(protein tyrosine kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信号通路上调Hepcidin的表达,所以我们提出假设：APS可能可以通过激活p38MAPK信号通路上调Hepcidin表达。研究目的和意义本研究拟以人肝癌HepG2细胞、人正常肝细胞L-02、C57BL/6小鼠和铁超载C57BL/6、鼠模型为研究对象,通过逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、Western blotting、空气-乙炔原子吸收法方法和多功能全自动生化分析仪等方法探讨APS是否能上调Hepcidin表达,如果提高了Hepcidin表达是否可减轻铁超载C57BL/6小鼠铁负荷,以及APS作用机制是否涉及激活p38MAPK信号通路及相关细胞因子。该研究成果将为验证黄芪治疗β-地中海贫血具有双重作用提供理论依据,为研发上调体内Hepcidin达到治疗铁负荷疾病提供新途径。方法1实验动物和细胞株C57BL/6雌性小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所。人肝癌HepG2细胞和人正常肝细胞L-02购自中科院上海细胞库。2动物和分组C57BL/6小鼠随机分为4组(每组8只)：①生理盐水组；②APS组：腹腔注射200mg/kg体重的APS,持续7天；③模型+生理盐水组：隔天腹腔注射右旋糖酐铁注射液(剂量为150mg/kg体重),持续4周；④模型+APS组：隔天腹腔注射右旋糖酐铁注射液(剂量为150mg/kg体重),持续4周后,腹腔注射200mg/kg体重的APS,持续7天。细胞分组：①HepG2或L-02细胞组；②APS+HepG2细胞(150mg/L APS处理48h)或L-02细胞(150mg/L APS处理72h)组；③SB+APS+HepG2细胞(10μM SB203580处理1h后,150mg/L APS处理48h)或L-02细胞(10μMSB203580处理1h后,150mg/L APS处理72h)组。3APS最佳浓度和诱导时间的确定分别用0mg/L、150mg/L、300mg/L、450mg/L和600mg/L APS处理HepG2和L-02细胞48h；用150mg/LAPS处理HepG2和L-02细胞0h、24h、48h、72h、96h和120h,通过RT-PCR方法检测各组细胞中Hepcidin.采用Bandleader3.0软件分析目的条带和内参照条带的灰度比值。4APS对Hepcidin表达的影响分别提取各组细胞和小鼠肝脏组织总蛋白并定量,通过Western blotting方法检测Hepcidin的表达,通过Bandscan5.0软件分析Western blotting条带灰度与内参照条带灰度比值。5血清铁及小鼠肝脏、脾脏和心脏中铁含量的检测制备小鼠血清,送新乡医学院第三附属医院检验科,采用多功能全自动生化分析仪检测血清铁。取新鲜肝、脾、心脏组织,通过空气-乙炔原子吸收法测定小鼠肝、脾和心脏中铁含量。6黄芪多糖上调Hepcidin的机制分别提取各组细胞和小鼠肝脏组织总蛋白并定量,通过Western blotting方法检测P38、p-P38、IL-1、IL-6和TNF-α的表达,通过Bandscan5.0软件分析Western blotting条带灰度与内参照条带灰度比值。7统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差(x±s)表示。多个样本均数的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA)。方差齐性检验如方差齐时多重比较采用LSD方法检验；如方差不齐时方差分析采用近似F检验Welch法,多重比较采用Dunnett’s T3方法检验。检验水准为α=0.05。结果1APS最佳浓度和诱导时间的确定RT-PCR结果显示；①与HepG2和L-02细胞相比,不同浓度APS诱导的HepG2(F=99.994, P=0.000)和L-02(F=148.305, P=0.000)细胞中Hepcidin表达均显著上调,均以150mg/L的APS诱导效果最佳(P=0.000)；②与HepG2细胞相比,150mg/LAPS诱导的不同时间点的HepG2细胞中Hepcidin表达均显著上调(F=57.813,P=0.000),以48h诱导效果最佳(P=0.000)；③与L-02细胞相比,150mg/LAPS诱导的不同时间点的L-02细胞中Hepcidin表达均显著上调(F=172.009,P=0.000),以72h诱导效果最佳(P=0.000)。鉴于以上研究结果,后续实验中,对于人肝癌HepG2细胞,APS诱导浓度和时间采用：150mg/L,48h。对于人肝细胞L-02,APS诱导浓度和时间采用：150mg/L,72h。2APS对人肝癌HepG2细胞和人肝细胞L-02中Hepcidin表达的影响Western blotting结果显示： APS可明显诱导HepG2(t=15.176, P=0.000)和L-02细胞中Hepcidin表达上调(t=8.880, P=0.000)。与对照组相比,HepG2细胞中Hepcidin表达上调3.64倍,L-02细胞中Hepcidin表达上调3.59倍。3C57BL/6小鼠高铁负荷模型的制备多功能全自动生化分析仪检测小鼠血清铁和空气-乙炔原子吸收法方法检测小鼠肝、脾、心脏铁含量的结果显示：与生理盐水组相比,模型+生理盐水组小鼠血清铁(t=22.851,P=0.000)、肝脏(t=67.361,P=0.000)、脾脏(t=32.078,P=0.000)和心脏(t=30.174,P=0.000)铁均显著增高。小鼠血清铁增高2.91倍、肝脏铁增高10.51倍、脾脏铁增高13.98倍、心脏铁增高5.41倍,小鼠高铁模型制备成功。4APS对C57BL/6小鼠肝细胞中Hepcidin表达的影响Western blotting结果显示；与生理盐水组相比,APS组、模型+生理盐水组和模型+APS组小鼠肝细胞中Hepcidin表达均显著上调(F=102.557,P=0.000)。与生理盐水组相比,APS组小鼠肝细胞中Hepcidin表达上调2.24倍,模型+生理盐水组小鼠肝细胞中Hepcidin表达上调2.22倍,模型+APS组小鼠肝细胞中Hepcidin表达上调3.36倍,其中,以模型+APS组C57BL/6小鼠肝细胞中Hepcidin表达上调最明显(P=0.000)。5APS对C57BL/6小鼠血清铁的影响多功能全自动生化分析仪检测小鼠血清铁变化的结果显示；与生理盐水组相比,APS组小鼠血清铁显著降低(P=0.000),而模型+生理盐水组、模型+APS组小鼠血清铁显著增高(P=0.000)。与模型+生理盐水组相比,模型+APS组小鼠血清铁显著降低(P=0.000),降低了32.96%,但仍高于生理盐水组和APS组(P=0.000)。6APS对C57BL/6小鼠肝、脾、心脏中铁含量的影响空气-乙炔原子吸收法方法检测小鼠肝、脾和心脏铁变化的结果显示：与生理盐水组相比,APS组小鼠肝脏、脾脏和心脏铁都显著降低(P=0.000),而模型+生理盐水组和模型+APS组小鼠肝脏、脾脏和心脏铁都显著增高(P=0.000)。与模型+生理盐水组相比,模型+APS组小鼠肝脏、脾脏和心脏铁显著降(P=0.000),分别降低了56.67%、51.13%和44.30%,但仍高于生理盐水组和APS组(P=0.000)。7APS对人肝癌HepG2细胞中P38表达和磷酸化的影响Western blotting结果显示：HepG2细胞、SB+APS+HepG2细胞和APS+HepG2细胞中P38的表达无显著变化(F=0.435,P=0.666)。与HepG2细胞相比,APS+HepG2细胞中P38磷酸化显著增加(P=0.000),而SB+APS+HepG2细胞中P38磷酸化显著低于APS+HepG2细胞(P=0.000),抑制率为77.07%。8APS对人肝细胞L-02中p38和磷酸化p38表达的影响Western blotting结果显示；L-02细胞、SB+APS+L-02细胞和APS+L-02细胞中P38的表达无显著变化(F=0.691,P=0.537)。与L-02细胞相比,APS+L-02细胞中P38磷酸化均显著增加(P=0.000),但SB+APS+L-02细胞中P38磷酸化显著低于APS+L-02细胞(P=0.000),抑制率为56.77%。9APS对C57BL/6小鼠肝细胞中P38表达和磷酸化的影响Western blotting结果显示；与生理盐水组相比,APS组、模型+生理盐水组和模型+APS组小鼠肝细胞中P38的表达无明显差异(F=2.669,P=0.119)。与生理盐水组相比,模型+生理盐水组P38磷酸化无显著差异(P=0.956),但APS组和模型+APS组小鼠肝细胞中P38磷酸化显著增加(P=0.000)。与生理盐水组相比,APS组小鼠肝细胞中P38磷酸化增加2.68倍。与模型+生理盐水组相比,模型+APS组小鼠肝细胞中P38磷酸化增加2.59倍。10APS对人肝癌HepG2细胞中IL-1、IL-6和TNF-α表达的影响Western blotting结果显示；与HepG2细胞相比,APS+HepG2细胞中IL-1(F=0.305,P=0.748)和TNF-α (F=1.285, P=0.343)的表达均无明显变化,而IL-6的表达显著上调(P=0.000),上调6.29倍。但SB可显著抑制APS对IL-6上调作用(P=0.000),抑制率为42.47%。11APS对人肝细胞L-02中IL-1、IL-6和TNF-α表达的影响Western blotting结果显示；与L-02细胞相比,APS+L-02细胞中IL-1(F=1.968, P=0.220)和TNF-α (F=0.400, P=0.687)的表达均无明显变化,而IL-6的表达显著上调(P=0.000),上调35.57倍。但SB可显著抑制APS对IL-6上调作用(P=0.000),抑制率为51.71%。12APS对C57BL/6小鼠肝细胞中IL-1、IL-6和TNF-α表达的影响Western blotting结果显示；与生理盐水组相比,APS组、模型+生理盐水组、模型+APS组小鼠肝细胞中IL-1(F=0.927,P=0.471)和TNF-α (F=0.632,P=0.615)的表达均无明显变化。与生理盐水组相比,模型+生理盐水组IL-6表达无显著差异(P=0.588),但APS组和模型+APS组小鼠肝细胞中IL-6表达显著增加(P=0.000)。与生理盐水组相比,APS组小鼠肝细胞中IL-6增加1.72倍。与模型+生理盐水组相比,模型+APS组小鼠肝细胞中IL-6增加1.72倍。13SB对APS诱导人肝细胞Hepcidin表达的影响Western blotting结果显示； APS可明显诱导HepG2细胞和L-02细胞中Hepcidin表达上调(P=0.000),而SB203580可显著抑制APS的该诱导作用(P=0.000),抑制率分别为55.31%和51.28%。结论1首次证实了APS能够上调Hepcidin的表达。2首次证实了APS能够减轻C57BL/6小鼠的铁负荷,而上调Hepcidin基因的表达可能是APS减轻C57BL/6小鼠铁负荷的重要机制之一。3证实了APS能够激活HepG2细胞,L-02细胞及小鼠肝细胞p38MAPK信号通路。4首次证实了APS诱导p38MAPK信号通路的激活可能是其上调Hepcidin基因表达的重要机制之一。5IL-6可能参与了APS经p38MAPK信号通路上调Hepcidin基因的表达。