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EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)属人疱疹病毒4型,感染超过95%的成年人。EBV感染与多种肿瘤的发生有关,但其致病机制尚不清楚。AQP3(Aquaporin 3)是一种水通道蛋白,其通过跨质膜的渗透梯度促进跨上皮水运输。有研究表明,AQP3在肿瘤进展和转移中起着关键作用,肿瘤细胞可能通过一系列信号传导机制(肿瘤细胞与细胞膜信号传导)促进细胞内AQP3的表达,为肿瘤侵袭与转移提供有利条件。EBV相关胃癌(EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC)约占全部胃癌病例的10%,具有独特的病理和分子特征。EBVaGC中存在多种肿瘤相关基因启动子区域的整体和非随机DNA甲基化,导致肿瘤相关基因的表达抑制。病毒通过影响细胞的多种生物学途径来刺激肿瘤发生,其中细胞表观遗传机制是最具特征的途径之一,DNA甲基化参与多种肿瘤的发生过程。DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferases,DNMTs)是细胞基因组DNA甲基化的关键效应酶,DNMTs的失调可导致包括抑癌基因在内的肿瘤相关基因启动子异常甲基化,导致基因沉默,肿瘤病毒在调控DNMTs的过程中发挥重要作用。目的:探讨EBVaGC中EBV对AQP3基因表达的影响及调控机制,明确EBV影响AQP3基因甲基化的机制,为阐明EBVaGC的发生发展提供理论依据。材料与方法:(1)实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39、SNU719以及EBV阴性胃癌(EBV-negative gastric carcinoma,EBVnGC)细胞系SGC7901、BGC823、HGC27中AQP3、甲基转移酶1(DNMT1)、甲基转移酶3a(DNMT3a)、甲基转移酶3b(DNMT3b)及相关基因的转录表达水平。(2)Western Blot检测EBV阳性胃癌和EBV阴性胃癌细胞系中AQP3、DNMTs及相关基因的蛋白表达水平;免疫组化检测EBVaGC和EBVnGC组织中AQP3蛋白的表达。(3)重亚硫酸氰盐测序(Bisulfite Genomic Sequence,BGS,BSP)检测AQP3基因启动子和第1外显子区的甲基化情况。(4)采用pcDNA3.1构建EBV编码小RNA(EBV-encoded small RNA,EBER)和EBV潜伏膜蛋白(Latent membrane protein,LMP)LMP1、LMP2A编码基因的表达载体,转染EBV阴性胃癌细胞系SGC7901后检测AQP3、DNMTs及相关基因表达的变化。(5)分别采用靶向ERK1和ERK2的小干扰RNA(Small Interfere RNA,siRNA)作用于稳定转染LMP2A后的SGC7901细胞系,检测干扰ERK1和ERK2后AQP3、DNMT3a及相关基因表达的变化。结果:(1)qRT-PCR检测结果显示,EBV阳性胃癌细胞系中AQP3基因转录水平明显低于EBVnGC细胞系(t=2.057,P<0.001);DNMT3a相反,EBV阳性胃癌细胞系中DNMT3a基因转录水平高于EBV阴性胃癌细胞系(t=3.139,P=0.0146);EBV阳性胃癌细胞系与EBV阴性胃癌细胞系比较,DNMT1基因转录水平没有显著差异(t=0.6179,P=0.5594);两种细胞系中DNMT3b基因转录水平也无显著差异(t=0.8166,P=0.4453)。(2)Western Blot结果显示,EBV阴性胃癌细胞系中AQP3蛋白的表达明显高于EBV阳性胃癌细胞系(t=8.857,P<0.001);而EBV阳性胃癌细胞系中DNMT3a蛋白的表达明显高于EBV阴性胃癌细胞系(t=10.20,P<0.001);EBV阴性胃癌细胞系DNMT1蛋白表达明显高于EBV阳性细胞系(t=9.374,P<0.001);两种细胞系中DNMT3b蛋白水平无显著性差异(t=0.1823,P=0.8576)。(3)胃癌组织中AQP3蛋白的表达与细胞系一致,免疫组化结果显示,EBVaGC组织中AQP3蛋白的表达明显低于EBVnGC。(4)3种EBV阳性胃癌细胞系中AQP3基因启动子和第1外显子区CpG岛呈高甲基化状态,甲基化率均高于70%;EBV阴性胃癌细胞系SGC7901与BGC823中甲基化率均小于3%,而EBV阴性胃癌细胞系HGC27中甲基化率为58%。(5)甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理EBV阳性细胞系GT39和SNU719,AQP3启动子和第1外显子区的甲基化率均降低至60%以下,DNMT3a蛋白表达受抑,AQP3基因在转录和蛋白水平表达恢复。(6)与转染对照质粒的EBV阴性胃癌细胞系SGC7901比较,转染EBV潜伏膜蛋白LMP2A的SGC7901细胞中DNMT3a表达升高,AQP3基因表达降低,p-ERK表达升高,ERK通路被激活;而在转染EBV潜伏膜蛋白LMP1或EBER的细胞系中,与转染对照质粒的细胞比较,DNMT3a、AQP3的表达没有明显变化。(7)在稳定转染EBV潜伏膜蛋白LMP2A的EBV阴性胃癌细胞系中分别采用siRNA靶向抑制ERK1或ERK2表达后,DNMT3a的表达下调,AQP3表达则上调。结论:EBVaGC中AQP3蛋白的表达抑制与AQP3基因启动子区和第1外显子区高甲基化相关,AQP3基因启动子区和第1外显子区的高甲基化可能由DNMT3a介导;EBV潜伏膜蛋白LMP2A可通过激活ERK通路上调DNMT3a的表达。