研究背景:何首乌(Polygonum multiflorumthunb)是我国传统补虚类中药,2015药典一部中对其具体描述是:补肝肾,益精血,乌须发,强筋骨,化浊降脂,用于血虚萎黄,眩晕耳鸣,须发早白,腰膝酸软,肢体麻木,崩漏带下,高脂血症等。结合现代药理学研究发现何首乌具有降血脂、抗动脉粥硬化,降血压,抗氧化和提高记忆等作用。但目前对其药效物质基础和作用机制并不十分清楚。国内外学者以及我们团队前期研究已证实,何首乌中的标志成分——二苯乙烯苷(2,3,5,4’-tetra-hydroxysilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG)的药理作用较为广泛,可通过抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集、保护血管内皮细胞功能和抑制血管平滑肌细胞的表型转化等途径达到抗动脉粥样硬化、抗高血压等作用,但对其舒血管作用及其机制尚鲜见报道。另外,有研究表明,高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia,HHcy)与高血压和动脉粥样硬化等心血管疾病的发病呈正相关。血中同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)≥15μmol/L就可直接损伤血管内皮细胞和平滑肌细胞,引起血管重构、平滑肌舒缩功能障碍,诱发HHcy型高血压,目前HHcy已成为新的引起心血管疾病的独立风险因子。虽然何首乌在以往的研究中表现出明确的抗动脉粥样硬化、降血压等作用,但是否可降低Hcy水平对抗HHcy型高血压引起的血管损伤目前尚不清楚。为了揭示何首乌及其标志成分TSG的舒血管作用和对HHcy诱发的高血压及血管损伤的保护作用及其作用机制,本课题主要完成了以下三个方面的研究:证实了何首乌中的标志成分——TSG具有显著的舒血管作用;明确了TSG的舒血管作用一方面依赖于抑制血管内皮细胞cox-2活性降低内皮细胞TXA2的释放,引起血管扩张。另一方面,则是直接作用于血管平滑肌细胞上的电压依赖性K+通道以及阻断细胞内Ca2+释放和外Ca2+内流,发挥舒血管作用;证实TSG可通过抑制MAPK/NF-кB/ETB信号轴,下调HHcy诱导的血管平滑肌细胞异常ETB受体的表达,发挥其舒张血管,降低HHcy型高血压的作用。研究方法:1、选用微血管张力检测系统在体外记录大鼠肠系膜上动脉血管环张力。观察何首乌提取物PME(二苯乙烯苷含量为71.2%)和高纯度TSG(二苯乙烯苷含量为98.1%)对基础状态大鼠肠系膜上动脉舒缩的影响;检测内皮完整和去内皮的微动脉血管在缩血管物质高钾和PE的诱导下PME对微动脉的舒张率;检测在缩血管物质高钾、PE和5-HT的刺激下TSG对微动脉的舒张率,并用血管压力直径测定系统实时观察二级动脉外径的变化。2、利用微血管张力检测仪在体外进一步观察内皮细胞在TSG舒张肠系膜上动脉血管中的作用;利用内皮细胞舒张血管通路和血管平滑肌细胞K+、Ca2+离子通道拮抗剂,检测血管环张力,观察TSG通过内皮细胞和血管平滑肌细胞舒张血管的作用途径;小鼠尾静脉注射垂体后叶素后复制急性血管收缩模型,实时监测其左颈总动脉平均血流量的变化,用ELISA法测定各组小鼠血中TXA2、PGI2、cox-1、cox-2的浓度。3、选用体外器官培养方法,利用微血管张力测定系统观察TSG对血管平滑肌在缩血管物质及内皮素受体激动剂ET-1、S6c作用下的舒张作用;Western Blot法检测血管平滑肌ETA、ETB受体表达及MAPK信号通路相关蛋白的表达。4、建立HHcy小鼠动物模型,TSG连续给药4周,无创血压测量分析系统动态监测各组小鼠血压变化;ELISA法检测血中Hcy、AngⅡ、ET-1、AD、NE、5-HT浓度;HE、masson、间苯二酚品红染色对主动脉和微动脉动脉血管进行病理组织学检查,观察血管形态结构变化、平滑肌纤维和胶原蛋白沉积;Western Blot法检测微动脉血管平滑肌ETA、ETB受体表达及MAPK信号通路相关蛋白及其磷酸化的变化。研究结果:1、何首乌提取物——PME(二苯乙烯苷含量为71.2%)可以浓度依赖的方式舒张PE或KCl预收缩的大鼠肠系膜上动脉,且PME对PE(10μM)或高钾(60m M)预收缩的内皮完整的大鼠肠系膜上动脉的舒张作用显著强于去除了内皮的大鼠肠系膜上动脉;TSG(二苯乙烯苷含量为98.1%)对KCl、PE或5-HT预收缩的大鼠肠系膜上动脉的舒张作用更明显;二者均对基础状态的大鼠肠系膜上动脉血管环(完整内皮)无明显的收缩或舒张作用,且实验前后,血管收缩能力无明显改变,因此推测TSG对血管无直接毒性。2、TSG对高钾、PE或5-HT预收缩的内皮完整的大鼠肠系膜上动脉的舒张作用显著强于去除了内皮的血管;L-NAME和ODQ并不能够影响TSG的舒张血管作用。提示,TSG诱导的血管舒张作用与NO无关;但TSG引起的血管舒张能够被Indo抑制,且选择性cox-2抑制剂尼美舒利显著增强TSG的血管舒张作用。同时在整体实验中:80mg/kg、160mg/kg TSG可降低垂体后叶素引起的急性小鼠血管收缩引起的平均血流量增加,间接反映TSG具有舒血管作用。TSG还可降低模型小鼠血清中TXA2、cox-2浓度。提示TSG可抑制cox-2活性,降低缩血管物质TXA2水平从而产生血管舒张作用增强;此外,4-AP可抑制TSG诱导的血管舒张,而Gli、Bacl2和TEA则没有抑制,表明TSG的舒血管作用与电压敏感K+通道有关。最后,还发现TSG可抑制PE诱导的血管平滑肌细胞肌浆网内Ca2+释放和K+诱导的细胞外Ca2+内流。3、体外培养24h后血管平滑肌对缩血管物质(KCl、PE或5-HT)及ETB受体激动剂S6c的敏感性显著增加,并引起血管平滑肌异常的ETA、ETB受体的表达上调,经TSG孵育24h后,可显著抑制上述物质对血管平滑肌的收缩作用,降低ETB受体的表达;Hcy孵育后使血管平滑肌对缩血管物质及ETB受体激动剂S6c的敏感性增加更为显著,可引起血管平滑肌异常的ETB受体的表达上调,经TSG与Hcy共孵育24 h后,可显著下调Hcy诱导的异常的ETB受体的表达,且对缩血管物质及ETB受体特异性激动剂——S6c诱发的血管收缩产生显著的拮抗作用,但对ETA受体的表达和ET-1诱发血管收缩并无影响。TSG也能够降低MAPK信号通路相关蛋白ERK1/2、JNK的表达。经TSG(10-4M,10-3.5M,10-3M)孵育24h后可显著抑制ETB受体特异性激动剂——S6c诱发的血管收缩,但对ET-1诱发血管收缩并无影响。Hcy体外诱导24h后,血管平滑肌ERK1/2蛋白的表达显著增加,但JNK、P38蛋白表达变化不明显,经TSG与Hcy共孵育24 h后,可显著下调血管平滑肌ERK1/2、JNK蛋白的表达,但对P38蛋白表达并无影响。4、TSG可降低HHcy小鼠血压,降低模型小鼠血中AngⅡ和ET-1浓度,并对HHcy引起主动脉和微动脉损伤有保护作用,可使主动脉胶原纤维沉积明显减少弹力纤维排列规则,断裂情况有所缓解,胶原纤维沉积减少;使微动脉胶原纤维沉积明显减少,弹力纤维大幅度增多,胶原纤维沉积明显减少。TSG可显著降低HHcy小鼠血管平滑肌p65蛋白的表达,抑制HHcy诱导增加的p65蛋白磷酸化,进而抑制MAPK信号通路相关蛋白ERK1/2、JNK蛋白表达,并抑制ERK1/2、JNK、P38蛋白磷酸化,阻断MAPK信号通路激活。下调血管平滑肌异常表达的ETB受体。研究结论:(1)二苯乙烯苷(TSG)是何首乌中主要的具有舒张血管作用的活性成分。(2)TSG一方面可通过内皮途径,抑制血管内皮细胞cox-2活性,降低TXA2的释放;另一方面,具有阻断血管平滑肌细胞上的电压依赖性K+通道和抑制细胞内Ca2+释放和外Ca2+内流。可分别影响血管内皮细胞和平滑肌细胞的功能,发挥舒血管作用。(3)TSG表现出良好的抗HHcy的作用。在体外TSG可能通过抑制血管平滑肌ERK1/2、JNK蛋白表达,下调ETB受体水平,降低Hcy诱发的血管平滑肌对缩血管物质的反应性,舒张血管;在体内TSG可通过降低血中Hcy水平,降低HHcy诱导升高的AngⅡ和ET-1水平,发挥其保护血管损伤,降低血压的作用;还可通过抑制MAPK/NF-кB/ETB信号轴,下调血管平滑肌细胞异常ETB受体的表达,发挥其舒张血管降低HHcy型高血压的作用。