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本研究以生鲜罗非鱼片为研究对象，运用PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术分析其在腐败过程中细菌群落的演替规律；并研究各种添加物、天然防腐剂和乳酸菌对罗非鱼片上腐败菌生长代谢的影响，在此基础上合理组合各种成分，研制成罗非鱼产品专用的天然防腐剂。 本论文的主要研究内容和研究结果如下： 1.通过比较试剂盒法和传统的酚、氯仿法提取鱼肉中细菌总DNA的效果，发现试剂盒法提取效率更高，故选用试剂盒法提取细菌总DNA。 2.分别以细菌16SrDNA通用引物338f/518r、341f/926r和968f/1401r对细菌16SrDNA的V3、V3～V5和V6～V8可变区进行PCR扩增，通过比较扩增产物的DGGE电泳效果得知V3区的PCR-DGGE条带数最多，分离效果最好，故选用扩增V3区的引物338f/518r。 3.通过PCR体系的优化，确定第一轮PCR反应体系(25μL)为：GoTaq Green MasterMix(2×)12.5μL引物各1μL(10μmol/L)，细菌DNA模板2μL，ddH2O8.5μL。第二轮PCR反应体系(50μL)为：GoTaq Green Master Mix(2×)25μL，引物各1μL(10μmol/L)，第一轮PCR产物1μL，ddH2O22μL。 4.通过DGGE水平电泳条件的优化，确定变性剂浓度梯度在40％～60％范围内，电压150V，电泳时间5h，温度60℃的条件下，DGGE水平电泳效果较理想。 5.通过对4℃有氧冷藏条件下生鲜罗非鱼片上细菌群落的PCR-DGGE分析表明，冷藏初期即第0～6d鱼片上的细菌包括8个属，即无色杆菌属(Achromobacter)、希瓦氏菌属(Shewanella)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、迪茨氏菌属(Dietzia)、紫色杆菌属(Janthinobacterium)；冷藏9d后鱼片发生腐败，无色杆菌属、希瓦氏菌属、嗜冷杆菌属和假单胞菌属的细菌逐渐成为优势种；冷藏第12d时出现黄杆菌属(Flavobacterium)细菌。其中假单胞菌属的细菌在整个冷藏过程中均存在，并且始终处于优势种地位，结合文献资料报道可以得知假单胞菌是生鲜罗非鱼制品的特定腐败菌。 6.对从腐败罗非鱼中分离的假单胞菌进行了鉴定，经细菌形态观察、生理生化反应，并经梅里埃细菌鉴定系统鉴定，确定荧光假单胞菌占17％，恶臭假单胞菌占17％，铜绿假单胞菌占66％。 7.研究了向罗非鱼鱼浆中添加葡萄糖对假单胞菌代谢特性的影响，结果显示，经13d冷藏后，当未添加葡萄糖的鱼浆中葡萄糖含量下降到初始含糖量60％时，假单胞菌开始分解利用鱼浆中的氨基酸，鱼浆pH值升高，TVBN等腐败产物明显增加，感官上出现明显腐败；而添加0.9％葡萄糖的鱼浆中经24d冷藏后，葡萄糖含量仍有0.78％，鱼浆pH下降，TVBN不变，感官上未出现明显腐败。因此，添加葡萄糖可明显减少假单胞菌对氨基酸的分解，进而减少腐败产物的产生，延长罗非鱼的保质期。 8.通过研究氯化亚铁对罗非鱼片冷藏过程中腐败菌生长代谢的影响可知，与对照组相比，氯化亚铁溶液浸泡后的罗非鱼片上的希瓦氏菌和嗜冷杆菌明显增多，即亚铁离子可能提高了希瓦氏菌和嗜冷杆菌对假单胞菌的竞争能力，但对抑制罗非鱼片上腐败菌没有明显作用。 9.以TVBN和细菌总数为指标，并结合PCR-DGGE技术比较研究了不同天然防腐剂对罗非鱼片上腐败菌生长的影响。结果表明生姜、大蒜、溶菌酶、茶多酚、Nisin、鱼精蛋白、壳聚糖、ε-聚赖氨酸等天然防腐剂对罗非鱼片均有一定防腐作用，其中生姜、大蒜、鱼精蛋白、壳聚糖的防腐效果较好。PCR-DGGE分析结果显示，Nisin和茶多酚对罗非鱼片上腐败菌无明显影响，ε-聚赖氨酸仅抑制部分劣势细菌；鱼精蛋白抑制假单胞菌属、希瓦氏菌属、黄杆菌属、迪茨氏菌属、紫色杆菌属，而嗜冷杆菌属和不动杆菌属与对照组相比却明显增多；壳聚糖不仅抑制鱼片上劣势细菌，还抑制希瓦氏菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、迪茨氏菌属和紫色杆菌属，但与对照相比不动杆菌属和短杆菌属增多；生姜液抑制鱼片上大部分劣势细菌，对假单胞菌的抑制作用与壳聚糖相比较弱；大蒜液抑制除假单胞菌属外的所有细菌的生长，而对假单胞菌属也有一定的抑制作用；溶菌酶抑制嗜冷杆菌生长，但假单胞菌和希瓦氏菌的数量与对照相比却明显增多。 10.根据各种天然防腐剂抑菌谱互补的原则配制针对罗非鱼产品专用的复合天然防腐剂。配方为：生姜20mL原汁/100mL、大蒜20mL原汁/100mL、鱼精蛋白0.6％、壳聚糖1.2％。此配方有效的抑制了罗非鱼片上腐败菌的生长，从而使4℃有氧冷藏条件下的罗非鱼片的货架期延长到15d以上，而不用防腐剂的罗非鱼片的货架期仅为9d。 11.比较了不同乳酸菌菌株对生鲜罗非鱼片的防腐效果，运用PCR-DGGE技术研究乳酸菌对罗非鱼片上腐败菌生长的影响，发现乳杆菌CICC6074可有效抑制罗非鱼片上假单胞菌、希瓦氏菌和其它腐败菌的生长，可使在4℃有氧冷藏条件下的罗非鱼片的货架期延长到16d以上，而对照组罗非鱼片的货架期仅为9d。