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蛋白激酶Z(PKZ)是一个近年来在鱼类报道的eIF2α激酶家族新成员,因此对它的功能研究并不多见。现在认为PKZ为鱼类特有的蛋白激酶,它能够结合并磷酸化eIF2α,最终诱导细胞凋亡。另外PKZ能响应多种病原体的感染并上调表达,但是对于其具体涉及的抗病毒信号通路还不清楚。在本研究中,草鱼PKZ为本课题的研究对象。草鱼PKZ蛋白由C端的eIF2α激酶催化结构域和N端的2个Z-DNA结合结构域组成。研究发现:在B-DNA和Z-DNA的刺激下,PKZ及先天免疫通路中的信号分子(IRF3,STING,ZDHHC1,IPS-1,TBK1和IFN)在mRNA水平都发生显著的上调,并且PKZ上调表达的时间都比较早,说明其发挥功能在感染早期。亚细胞定位分析表明PKZ定位于细胞质中,这也就为其在胞质中识别外源核酸提供了可能。DNA-pulldown实验证实PKZ更偏好结合DNA分子,而不结合RNA分子,而且PKZ的N端Z-DNA结构域能结合DNA分子,而C端的eIF2α激酶区却不能,表明N端的Z-DNA结构域是其结合DNA分子活性区。我们从mRNA、蛋白质、启动子活性水平均证实了PKZ能够启动Ⅰ型干扰素的表达。说明PKZ能够启动先天免疫反应。免疫共沉淀实验发现PKZ能够与IRF3信号通路中的IRF3,STING,ZDHHC1及ISGF3-like信号通路中的IRF9和STAT2发生相互作用。实验证明PKZ能够激活IRF3和STAT2的活性。这些结果说明PKZ是通过IRF3和ISGF3依赖的信号通路实现信号传递。为了深入研究PKZ分别与IRF3、ISGF3-like依赖信号通路的关系,我们发现如果敲降PKZ对IRF3及ISGF3-like信号通路产生了明显抑制作用,同样,敲降IRF3和IRF9,对PKZ的传递信号也产生明显的抑制效果,这就说明PKZ与IRF3和ISGF3-like信号通路是相互依存关系。表明PKZ能作为鱼类当中特有DNA识别受体,并且通过IRF3和ISGF3-like依赖的信号通路启动Ⅰ型干扰素的表达。另外,本研究深入探索草鱼IRF3依赖的信号通路。通过文献查阅发现两个与DNA病毒诱导相关蛋白ZDHHC1、STING在其中起重要的作用。首先通过同源克隆获得了草鱼ZDHHC1和STING的全长cDNA序列,然后对STING和ZDHHC1的细胞定位进行了分析。发现STING与ZDHHC1都定位于内质网上,这就说明它们可能具有一定的功能联系。ZDHHC1及STING能响应B-DNA和Z-DNA的刺激并上调表达;通过检测Ⅰ型干扰素的mRNA、蛋白质、启动子活性水平表明:在CIK细胞中过表达STING和ZDHHC1能够激活Ⅰ型干扰素的表达,反之敲降STING或者ZDHHC1显著抑制了Ⅰ干扰素的表达。为了探索STING和ZDHHC1上调Ⅰ型干扰素表达的机制,我们开展了免疫共沉淀、免疫荧光、GST-pulldown和双分子荧光互补实验,结果表明STING和ZDHHC1能分别于IRF3发生相互作用,并且STING能与ZDHHC1发生直接的相互作用。这也就说明STING首先与ZDHHC1形成二聚体后然后招募IRF3。随后的激活实验表明STING与ZDHHC1能促进IRF3发生二聚化及核转位。结果证明了鱼类STING与ZDHHC1在DNA病原核酸刺激时,在内质网上形成二聚体,随后招募IRF3,并促使它激活进入核内启动Ⅰ型干扰素的表达。本文第三部分对鱼类IRF3的自调控进行了分析,发现IRF3在众多干扰素调控因子中起主导地位。首先通过tail-PCR技术克隆了草鱼IRF2、IRF3的启动子序列,并将它们与实验室前期克隆获得的草鱼IRF1和IRF7启动子进行元件分析,结果发现在这些启动子上都发现了IRF-E元件。启动子亲和分析实验表明草鱼IRF3原核蛋白能够与IRF1、IRF2、IRF3、IRF7启动子发生结合。随后在mRNA及启动子活性水平证明IRF3能够上调IRF1、IRF2、IRF3及IRF7的转录水平。这些结果表明草鱼IRF3不仅能调控Ⅰ型干扰素及ISG基因的表达,而且它还能调控IRF1、IRF2、IRF3、IRF7的表达从而影响控制整个先天免疫强度。