脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是严重的中枢神经损伤，致死、致残率高，严重危害人民健康，给家庭和社会带来巨大的经济和精神负担。长期以来，脊髓损伤的治疗作为全球医学界尚未解决的重大难题之一，仍然缺少实质性改善受损脊髓功能的治疗手段。现有的临床治疗手段主要是早期应用大剂量激素及手术治疗等，但是对于脊髓损伤的治疗效果均不佳。近年来，移植外源性干细胞促进脊髓损伤修复成为目前的研究热点。 骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种成体干细胞，具有自我更新及多向分化潜能，移植入体内后能够分化为神经元样细胞替代死亡的神经细胞，建立神经通路或分泌营养因子，挽救损伤神经，促进轴突再生等发挥作用。且具有易于获取、来源丰富、没有明显移植排斥反应、易于转染外源基因等优点，在治疗脊髓损伤方面有很好的应用前景。然而，干细胞移植入体内后迁移和分布的机制仍不明确。 为追踪干细胞移植后体内的迁移和分布，以往的试验大多采用病理学手段，以GFP、Brdu等标记移植细胞后移植到损伤脊髓内，在多时间点处死动物取组织切片，用免疫组化、免疫荧光的方法来检测移植细胞。但是以上方法需要在不同时间点处死实验动物以获取观察材料，所以无法在同一活体动物体内连续多时间点的观察移植细胞的迁移、分布及分化情况，在科研与临床研究中存在许多限制。分子影像学(molecular imaging，MI)是分子生物学与现代医学影像技术相结合的产物，是一门新兴的边缘学科。1999年美国哈佛大学Weissleder等人首先提出分子影像学的概念，即应用影像学方法，对活体状态下体内分子的生物化学过程进行定性和定量研究。磁性标记作为分子影像学技术中较有优势的一种，是将磁性对比剂转入干细胞后移植入体内，借助磁共振成像(MRI)显示标记的细胞，能够在活体特异性的连续追踪移植细胞，具有良好的组织分辨率、无创伤、无电离辐射等优点；并且可以很方便的应用相关软件经过三维重建来反映干细胞分布的全貌，十分适合追踪干细胞在体内的迁移和分布。 目前MSCs移植修复脊髓损伤的途径主要有：原位、蛛网膜下腔和静脉三条，主要以原位注射为主。磁性标记干细胞体内示踪较多采用的是铁标记(SPIO)，该标记方法在T2上的图像会受到出血的影响，原位注射过程导致的出血是无法完全避免的，这影响了铁标记在脊髓损伤原位移植细胞的示踪中的应用。而钆(Gd)标记为T1正性信号，不会受到出血等于扰因素的影响，但目前钆标记与铁标记相比，分辨率低下是其主要问题。蛛网膜下腔注射与原位移植相比，损伤小，迁移到损伤部位的干细胞又远远高于静脉移植，是有应用前景的移植方法，目前对于蛛网膜下腔注射的MSCs是如何迁移到脊髓损伤部位的了解仍很少。 本课题组在前期研究中构建了大鼠脊髓损伤模型，建立了一整套分离培养BMSCs的方法，将MSCs移植到大鼠脊髓损伤原位，改善了损伤的神经功能，以免疫组化、免疫荧光等方法观察到了移植细胞的存活和分化。本研究在前期工作的基础上，结合分子影像学的最新进展，针对脊髓损伤中不同移植方式的特点，分别采用Gd和Fe标记损伤原位和蛛网膜下腔移植的MSCs，以3TMRI和小动物线圈追踪移植细胞在体内的迁移和分布，并与GFP标记的病理结果、功能评分的改善等相验证，全面客观的评价移植细胞在脊髓损伤模型中的迁移和分布。 本研究包括以下二个部分： 第一部分：钆标记骨髓间充质干细胞在脊髓损伤原位移植后的示踪研究 方法：实验分为体外、体内两部分。体外部分：以Jetpei、鱼精蛋白转染试剂标记MSCs，在MRI下检测标记细胞的信号强度；以扫描电镜确认标记的Gd颗粒在细胞内的分布；以MTT、台盼蓝、多向诱导分化实验检测标记后对细胞增殖、分化等生物学活性的影响。体内部分：制作大鼠脊髓损伤模型，观察其在MR下的图像特点；移植未标记的MSCs，观察MR下信号的改变；移植GFP、Gd-DTPA/Jetpei标记的MSCs，连续观察移植后1、3、7、14天的MRI图像，并在相应时间点取材切片，以免疫荧光验证MRI上的发现。以BBB评分评价Gd—DTPA标记的MSCs、未标记的MSCs对运动功能恢复的影响。 结果：体外部分：Gd—DTPA/Jetpei能够高效标记MSCs，标记效果(信号强度)远高于鱼精蛋白和单纯的Gd—DTPA；电镜显示标记后Gd颗粒位于胞膜和胞浆中；Gd标记不影响MSCs的增殖和多向分化。体内部分：大鼠脊髓损伤模型以水肿表现为主，在MRI上呈T2高信号，原位移植未标记细胞以出血表现为主，在MRI上呈T2低信号，均不影响T1信号。Gd标记的MSCs在MRI上呈T1高信号，可连续观察到至少14天，相应时间点取材切片的病理结果(免疫荧光)与MRI相符合，移植细胞3天时主要位于注射原位，后逐渐分布到整个损伤节段，但又不超出损伤节段。Gd标记的MSCs也可明显促进脊髓损伤运动功能的恢复，与未标记的MSCs相比无明显差异。 结论：以Jetpei转染Gd—DTPA入MSCs，是高效低毒的T1正性标记方法，适合原位移植MSCs的体内示踪和其它有出血因素存在情况下的移植细胞的示踪。 第二部分：铁标记骨髓间充质干细胞在脊髓损伤蛛网膜下腔移植后的示踪研究 方法：用携带绿色荧光蛋白的腺病毒(AD5/F35-EGFP)和SPIO标记分离纯化后的MSCs，免疫荧光和普鲁士兰染色显示标记效果。制作大鼠脊髓损伤模型，并进行蛛网膜下腔置管成功的10只SD大鼠，随机分为2组，将标记细胞(实验组，n＝5)和未标记细胞(对照组，n＝5)经蛛网膜下腔移植入模型鼠。在移植前、移植后3天、7天、14天用3TMRI对移植细胞进行活体示踪，并与损伤脊髓组织切片GFP表达对照。 结果：AD5/F35-EGFP和SPIO可以高效标记MSCs，标记细胞表达绿色荧光，普鲁士兰染色显示MSCs胞质内出现蓝色铁颗粒，标记对细胞增殖活力没有明显的影响。蛛网膜下腔移植标记细胞到大鼠脊髓损伤模型，可以在MRI下观察到损伤区域逐渐增强的T2低信号，组织切片荧光的发现与MRI结果一致，提示蛛网膜下腔移植的MSCs可以迁移到脊髓损伤局部。未标记细胞组MRI下无明显低信号改变。 结论：SPIO纳米颗粒可以有效标记MSCs，蛛网膜下腔移植的MSCs可以迁移到脊髓损伤区域，利用MRI可以对移植细胞进行活体示踪。 实验总结 本研究结论如下： 1.Gd—DTPA/Jetpei能有效标记MSCs，标记不影响细胞的生物学活性 2.SPIO能有效标记MSCs，标记不影响细胞的生物学活性 3.MSCs原位注射和经蛛网膜下腔注射移植到大鼠脊髓损伤模型后均可以在损伤区分布和存活，并促进功能恢复。 4.Gd—DTPA标记引起T1高信号，适用于体内动态追踪原位移植的MSCs；SPIO标记引起T2低信号，适用于体内动态追踪蛛网膜下腔移植的MSCs。 MSCs通过不同途径移植入大鼠脊髓损伤模型中后可以迁移到损伤区域存活并发挥功能，磁性标记体内示踪可以全面、客观评价移植细胞的迁移与分布。本实验根据不同移植途径的具体需要，分别选用临床常用的Gd类造影剂Magnevist和SPIO类造影剂Resovist转染MSCs，所得资料可为揭示MSCs修复脊髓损伤的机制提供实验依据；建立的标记方法高效低毒，适用于动态追踪MSCs和其它干细胞各种于不同移植途径后的体内示踪，尤其适用于大动物如灵长类中的示踪及未来的临床研究。