论文部分内容阅读
1.背景与目的 已有大量证据证明，外周炎症可以诱导脑内炎症的形成，并最终引起神经退行性病变的发生。中枢神经系统炎症反应是神经退行性病变如帕金森病的重要特征之一。其中一个著名的实验表明，给予外周大剂量LPS注射后可以引起脑内长时间的炎症因子的升高和迟发型的多巴胺能神经元死亡。最近的研究证实了在帕金森模型中，肠道微生物可以调节脑内炎症和运动症状。这些证据表明，外周免疫异常与PD的发生发展有着密切的联系。 小胶质细胞是中神经系统的免疫监视者，它在调节脑内微环境中起到重要作用。在病理条件下，小胶质细胞可以从静息状态转化为阿米巴样状态，并引发一系列的炎症反应，如产生细胞因子，趋化因子，氮氧化物，氧自由基等等，并且可以与其他胶质细胞，血脑屏障细胞(BBB)及神经元相互作用，影响它们的功能。小胶质细胞活化石神经退行性病变的典型病变标志。许多研究证实了小胶质细胞介导的炎症反应可以引起神经元的损伤。 单核细胞是外周固有免疫的核心参与者。最近，越来越多的研究关注于单核细胞在神经系统疾病中发挥的作用。一方面，单核细胞与小胶质细胞具有同源性，二者被认为来源于髓系细胞，具备相同的抗原，功能和调节机制。在许多动物研究中均证实单核细胞可以入侵中枢神经系统并发挥免疫调节作用。另一方面，一些研究发现PD患者的单核细胞的功能出现异常，亚型也发生变化。这些发现均提示我们外周单核细胞与神经退行性病变有着密切联系。 CD200是一种表面糖蛋白，在脑内，CD200主要表达于神经元，而它的配体CD200R1则主要表达于小胶质细胞。先前的实验已经证明了CD200R1的激活可以抑制髓系细胞的活性，如巨噬细胞，小胶质细胞。CD200缺陷小小鼠表现出了异常的小胶质细胞激活状态以及对脑脊髓炎的异常敏感性。相反的，CD200R1激动剂，即CD200Fc可以抑制年龄相关的和LPS诱导的小胶质细胞激活，减轻胶质细胞激活的相关炎症反应以及抑制神经退行性病变的发展。 小胶质细胞，单核细胞及CD200-CD200R1通路在内源性神经炎症及神经退行性病变中已有广泛的研究。然而在外周炎症介导的脑内炎症及神经退行性病变中它们的作用尚不明确。外周与中枢如何相连使得外周炎症可以传入脑内目前的机制也尚不明确。我们的研究旨在探究在外周炎症诱导形成脑内炎症的过程中，外周单核细胞，脑内小胶质细胞及CD200-CD200R1通路在这一过程中的作用。 2.研究方法 2.1动物分组 (1)正常对照组:不做处理。 (2) LPS注射组:给予大鼠外周腹腔注射LPS。 (3)耗竭单核细胞+LPS注射组:大鼠在外周LPS注射18小时前鼠尾静脉注射氯膦酸二钠脂质体 (4)耗竭小胶质细胞+LPS注射组:大鼠在外周LPS注射24小时前黑质立体定向注射氯膦酸二钠脂质体 (5) Veh组:给予右侧黑质立体定向注射无菌PBS (6) Veh+LPS注射组:给予右侧黑质立体定向注射无菌PBS2小时后给予腹腔注射LPS (7) CD200Fc组:右侧黑质立体定向注射CD200R1激动剂CD200Fc (8) CD200Fc+LPS注射组:右侧黑质立体定向注射CD200R1激动剂CD200Fc2小时后给予腹腔注射LPS (9) anti-CD200R1组:给予右侧黑质立体定向注射CD200R1拮抗剂anti-CD200R1抗体 (10) anti-200R1+LPS注射组:给予右侧黑质立体定向注射CD200R1拮抗剂抗CD200R1抗体2小时后给予腹腔注射LPS。 2.2实验方法 (1)单核细胞耗竭的验证 大鼠鼠尾静脉注射氯膦酸二钠脂质体后18小时，打开腹腔，腹主动脉取血，流式细胞法检测单核细胞在血细胞中的浓度。 (2)小胶质细胞耗竭的验证 大鼠黑质立体定向注射氯膦酸二钠脂质体24小时后，打开腹腔，多聚甲醛灌流取脑做切片，Iba-1免疫组化染色，判定小胶质细胞耗竭情况。 (3) RNA提取、反转录及实时定量PCR 用TRIzol提取黑质RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit反转录试剂盒对提取的黑质RNA进行反转录，使用SYBR(@) Premix Ex TaqⅡ在LightCycler(@)480ⅡReal-time PCR仪上进行实时定量PCR反应。数据应用2-△△CT法分析。 (4)免疫荧光及免疫组化 大鼠麻醉后，打开腹腔，用生理盐水和4％多聚甲醛经心脏灌注固定，制作冰冻切片。捞片法进行免疫荧光染色，DAB进行免疫组化染色。 (5)数据分析 应用SPSS17.0软件进行数据分析。数据用平均值±标准误(SEM)来表示。Students unpaired t检验用于检测两个平均值之间的差异。对于多组比较，我们首先测量了方差齐星。在方差齐的情况下，采用one-way ANOVA以及LSD的事后检验检测多组之间的差异。在房差不齐的情况下，应用Welchs检验及DunnettT3检验进行多组间的差异比较。p＜0.05被认定为具有显著差异。 3.结果 (1)我们的研究表明外周LPS注射可以激活脑内小胶质细胞并引起脑内促炎症因子表达的增高及小胶质细胞的持续激活。 (2)耗竭单核细胞可以抑制外周炎症诱导的脑内促炎症因子表达的增高及小胶质细胞的持续激活。 (3)耗竭小胶质细胞可以抑制外周炎症诱导的脑内促炎症因子表达的增高，然而不能抑制多巴胺能神经元的凋亡。 (4)外周LPS注射可以引起脑内CD200，CD200R1表达的增高。 (5)提前给予黑质立体定向注射CD200Fc可以抑制外周LPS注射诱导的脑内小胶质细胞的激活及多巴胺能神经元的凋亡，反之提前给予黑质立体定向注射抗CD200R1抗体可以增加外周LPS注射诱导的脑内小胶质细胞的激活及多巴胺能神经元的凋亡。 4.结论 这些结果表明在炎症由外周传入脑内的过程中，外周单核细胞和脑内小胶质细胞分别在外周免疫和中枢免疫中起到关键作用，耗竭或减少二者其一均可以抑制外周炎症的脑内传入过程。同时,脑内CD200-CD200R1通路在外周炎症诱导的中枢炎症反应和神经退行性病变中起到关键调控作用。