共表达siRNA-Stat3与GRIM-19质粒对甲状腺癌细胞的抑制效应及机理探讨

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甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤,虽然绝大多数甲状腺肿瘤可以通过手术、131I、抑制TSH治疗获得良好的效果,但是仍有15%左右的病人因低分化早期转移而失去治疗机会。其中髓样癌、未分化癌和鳞癌的预后则更差,且对放、化疗不敏感。另外,部分分化较好的肿瘤,因为首次手术治疗不规范而出现局部复发,再次手术的风险大大增加。因此,我们对于这类难治性甲状腺癌寻求新的治疗方法,以改善病人预后,提高生存期,非常有现实意义。STAT3是JAK-STAT信号转导途径中,Janus激酶的底物。该途径调节细胞的生长增殖,如果持续性激活,可导致细胞异常增殖与恶性转化。目前已在多种肿瘤组织中,证实有Stat3的持续高表达,应用RNAi技术沉默Stat3的表达后,发现有显著的抗肿瘤效应。GRIM-19是STAT3的特异性抑制蛋白,可与STAT3蛋白结合,抑制其转录激活功能,从而阻止细胞生长增殖、促其凋亡。在哺乳动物细胞中,RNAi并不能完全阻断基因的表达,尤其是异常高表达的基因,为了寻求更好的治疗方案以加强疗效,我们采取了siRNA-Stat3联合GRIM-19的基因治疗方法。目的:本研究观察siRNA-Stat3联合GRIM-19共表达质粒(pGRIM-19-Si-Stat3)对人甲状腺癌细胞SW579的抑制效应,并探讨其作用机制。方法:本实验分为五个组,分别为脂质体对照组(mock组)、空白质粒对照组(psi-Scramble组)、psi-Stat3组、pGRIM-19组以及pGRIM-19-si-Stat3组(pGS组)。脂质体法将各组质粒转染人甲状腺癌SW579细胞。(1)转染48h后相差显微镜下观察各组癌细胞生长情况及形态特征;(2)采用半定量逆转录PCR检测各组癌细胞Stat3和GRIM-19表达水平;(3)Western blot法检测STAT3、GRIM-19及Stat3的下游靶基因Bcl-2与MMP9蛋白表达情况;(4)MTT法检测各组质粒对SW579细胞增殖活性的影响;(5)划痕实验及Transwell实验观察各组质粒对SW579细胞迁移和侵袭的作用。结果:(1)半定量RT-PCR与Western blot结果显示pGS组与其余四组相比,Stat3表达下降,GRIM-19基因表达升高;pGS组Bcl-2、MMP9的蛋白表达明显下降;(2)显微镜下,pSi-Stat3组、pGRIM-19组与两个对照组相比,呈病态改变,细胞皱缩、变圆,细胞稀疏,细胞周围可见颗粒样物;pGS组细胞改变更加明显,细胞稀少,并可见到细胞碎片。(3)MTT实验数据显示,pGS组SW579细胞增殖活性受到明显抑制,共表达质粒表现出良好的协同作用;(4)划痕实验及Transwell实验的结果提示pGS组SW579细胞相比于其他各组,迁移和侵袭性明显降低。结论:(1)共表达质粒pGS对SW579细胞有抑制增殖、促进凋亡的作用,并降低了其侵袭与迁移能力,与单一的psi-Stat3或pGRIM-19比较,有明显的协同作用。(2)pGS治疗甲状腺癌的机制可能是一方面siRNA-Stat3抑制了Stat3的基因表达;另一方面增强表达的GRIM-19抑制了STAT3的转录激活功能。两方面协同作用于Stat3,导致其下游MMP9和Bcl-2的基因表达下降,从而最终抑制了细胞增殖、侵袭和迁移能力,导致细胞凋亡。
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