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目的:不同剂量的邻苯二甲酸单丁酯(monobutyl phthalate,MBP)和邻苯二甲酸单(2-乙基)己酯(mono(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP)及其联合染毒体外干预小鼠睾丸间质细胞(TM-3),进而探讨MBP、MEHP对TM-3自噬、对第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因蛋白/苏氨酸激酶(PTEN/AKT)通路的影响,探讨联合染毒的交互作用以及自噬和凋亡之间可能的关系。方法:1,预实验CCK-8实验设置MBP、MEHP浓度0(对照组)、50、100、200、400、800μmol/L,作用TM-3细胞24h,参考改良寇氏法计算出的半数抑制剂量来确定后续染毒剂量;设置MBP、MEHP浓度0、200、400、800μmol/L和MBP+MEHP浓度400μmol/L,利用CCK-8法检测染毒时间设置为24、36、48 h MBP、MEHP对TM-3细胞活性的影响;2,利用倒置相差显微镜观察各染毒组对TM-3细胞正常形态的影响;3,MDC荧光法检测不同浓度MBP、MEHP和MBP+MEHP对TM-3细胞自噬的诱导情况;4,在透射电子显微镜下观察各后细胞超微结构发生的改变情况;5,用Annexin V-FITC/PI法检测各染毒组TM-3细胞凋亡的改变情况;6,采用免疫印迹法(Western blot)检测TM-3细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、泛素结合蛋白p62(p62)、PTEN、AKT以及凋亡相关蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白相对含量的变化。结果:1.CCK-8结果显示:与对照组相比,细胞存活率随着MBP、MEHP染毒剂量增高而降低(P<0.05)。MDC法检测结果显示:与对照组荧光信号强度相比,200μmol/L MBP、MEHP组荧光信号强度差异无统计学意义(P>0.05);400、800μmol/L MBP、MEHP组荧光信号强度随着浓度增加而增加(P<0.01)。Western blot结果分析显示:与对照组相比,200μmol/L MBP、MEHP组自噬相关蛋白LC3II/LC3I、p62蛋白相对含量差异无统计学意义(P>0.05);400、800μmol/L MBP、MEHP组LC3II/LC3I、PTEN蛋白相对含量增加(P<0.05);200μmol/L MBP组p62蛋白相对含量与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),400、800μmol/L MBP组p62蛋白相对含量降低;200、400、800μmol/L MEHP组p62蛋白相对含量降低;MBP、MEHP组p-AKT/AKT蛋白相对含量降低(P<0.01)。2.与对照组相比,CCK-8结果显示:MBP和(或)MEHP染毒TM-3细胞的存活率均下降;电镜观察细胞结构改变情况结果表现为:对照组:胞质中可见线粒体、内质网结构较为完整,偶可见空泡;MBP染毒组:可见具有完整双层膜结构的自噬小体,线粒体数目减少,内质网腔体扩张,胞质中膜状结构增多,溶酶体增多;MEHP染毒组:细胞空泡化现象进一步加剧,胞质中细胞器数量严重减少,可见自噬溶酶体;MBP+MEHP联合染毒组:胞质中仍可见完整的线粒体,存在空泡化现象、多囊泡结构,并可见自噬小体。MDC结果显示:各染毒组荧光信号强度均表现为增高。Western blot结果分析显示:与对照组相比,MBP、MEHP和MBP+MEHP染毒组LC3II/LC3I蛋白相对含量增加(P<0.01),p62蛋白相对含量降低(P<0.01),PTEN蛋白相对含量增加(P<0.05),p-AKT/AKT蛋白相对含量降低(P<0.05)。经2×2析因设计方差分析MBP、MEHP联合染毒交互作用,结果显示:MBP和MEHP联合染毒对TM-3细胞的活性、自噬囊泡的荧光信号强度、LC3II/LC3I和p62蛋白表达水平均具有交互作用,并且MBP+MEHP联合染毒组阳性反应率0.05);细胞存活率随着干预剂3-MA浓度增加而降低(P<0.05)。MDC结果显示:对照组荧光信号强度低,MBP+MEHP染毒组荧光信号强度升高,3-MA+MBP+MEHP干预组较MBP+MEHP组相比荧光信号强度降低,但比对照组高;Annexin V-FITC/PI法检测各处理组凋亡情况变化,结果分析显示:与对照组早期凋亡率相比,MBP+MEHP组细胞早期凋亡率增高(P<0.05);与MBP+MEHP组相比,3-MA+MBP+MEHP干预组细胞早期凋亡率增高(P<0.05)。Western blot结果分析显示:与对照组相比,MBP+MEHP染毒组自噬标志蛋白LC3II/LC3I蛋白相对含量增加、p62蛋白相对含量降低(P<0.01),凋亡相关蛋白Bax相对含量增加、Bcl-2相对含量降低(P<0.01);与MBP+MEHP组相比,3-MA+MBP+MEHP组自噬相关蛋白表达情况为:LC3II/LC3I含量降低(P<0.05),p62含量增加(P<0.01),凋亡相关蛋白Bax增长(P<0.05),Bcl-2降低(P<0.01)。结论:1.MBP、MEHP、MBP+MEHP能够破坏TM-3细胞基本形态,破坏细胞内质网、线粒体等超微结构,诱导胞质内产生自噬体;2.MBP、MEHP以及MBP+MEHP染毒致TM-3细胞自噬水平升高,并且PTEN通过抑制AKT磷酸化,正向调节细胞自噬;3.MBP+MEHP联合染毒的交互作用表现为拮抗作用;4.MBP+MEHP染毒引起TM-3自噬和凋亡程度升高,并且细胞自噬可能通过抑制细胞凋亡,发挥其保护作用。