研究背景动脉粥样硬化性心脏血管疾病(Atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)是CVD的重要疾病组成部分。近年来,随着ASCVD越来越受到重视,学者对于AS的研究学说也越来越深刻,“脂质浸润学说”、“损伤-反应学说”和“炎症学说”已成为AS发病机制的主流学说。动脉粥样硬化是一种复杂的慢性炎症性疾病,动脉管壁富含胆固醇的巨噬细胞积聚所导致的脂质代谢失衡及不适应性免疫炎症反应发挥着“推波助澜”的致病作用。巨噬细胞源性泡沫细胞的形成是AS发生发展过程中的主要特征。AS的主要表现是血管内皮细胞受修饰型低密度脂蛋白持续的慢性影响出现损伤,单核细胞、淋巴细胞等炎症细胞在内皮受损处粘附、聚集,单核细胞分化成巨噬细胞,巨噬细胞表达的清道夫受体(Scavenger receptors,SR)通过摄取修饰型低密度脂蛋白形成泡沫细胞;炎症细胞聚集后产生大量炎症介质,如肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)、白细胞介素 6(Interleukin 6,IL-6)、干扰素γ(Interferon γ,INF-γ)等,进而促进炎症反应,加速AS的进展。因此,从脂质代谢和炎症反应角度寻找抗AS及CVD的新靶点具有重大科学意义及临床价值。PSRC1(Proline/serine-rich coiled-coil protein 1),即脯氨酸/丝氨酸丰富的卷曲螺旋蛋白1,又名DDA3,是一个编码蛋白基因。PSRC1的早期研究多集中于肿瘤、细胞增殖、细胞分裂、微管蛋白调节等领域。21世纪人类基因图谱公布后,2007年SamaniNJ等在新英格兰医学杂志发表的冠心病全基因组学关联研究(Genome-Wild Association Studies,GWAS)首次证实 PSRC1 基因表达水平与血液中总胆固醇浓度密切相关。紧随其后,大量的GWAS也同样证实PSRC1基因的转录水平或基因多态性HDL-C低水平、LDL-C高水平以及冠心病风险存在显著性关联。另外,研究资料表明,CELSR2/PSRC1/SORT1基因座中的两个相关SNPs与血清CRP水平之间存在潜在的新型多效性关联,这可能会提供更多炎症途径的新认识。由此可知,PSRC1与血脂代谢、炎症反应及冠心病的发生紧密联系。我们课题组的前期研究发现,血清淀粉样P物质(Serum amyloid P component,SAP)刺激小鼠巨噬细胞后,其胆固醇转出率明显升高,细胞内胆固醇含量降低,细胞泡沫化程度减弱。同时,基因测序提示SAP刺激组相比对照组的PSRC1基因表达升高,沉默PSRC1基因后,可逆转SAP的抗巨噬细胞泡沫化的生物学效应。综上所述,PSRC1与脂质代谢、炎症反应及冠心病的发生紧密联系,但是PSRC1具体依赖何种途径又是否能够发挥抗AS作用的资料报道均较少。因此,本研究通过构建重组腺病毒转染RAW264.7巨噬细胞模型,探讨PSRC1基因过表达对巨噬细胞脂质代谢和炎症反应的影响及机制,将为AS的防治提供新靶点和新思路。研究目的本实验研究通过构建重组腺病毒转染RAW264.7巨噬细胞模型,探讨PSRC1基因过表达对巨噬细胞脂质代谢和炎症反应的影响及机制,将为AS的防治提供新靶点和新思路。研究方法1、重组腺病毒的构建过程鼠源性PSRC1基因序列查阅自Genebank。重组腺病毒GFP(Ad-GFP)和重组腺病毒PSRC1(Ad-PSCR1)的构建由上海和元生物技术股份有限公司完成。Ad-GFP作为阴性对照组。病毒载体构建完成后经CsCl超热法提纯并储存于-80中备用。2、细胞培养与实验分组RAW264.7细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中,并贮存在37℃、5%C02饱和湿度的培养箱中。12h后,分别用同体积的Ad-GFP和Ad-PSRC1转染并培养细胞48h。实验实施前,各组细胞进行饥饿24h,饥饿处理后用10Oμg/ml的ox-LDL干预巨噬细胞48h后,并收取样本实施后续的检测。实验研究分为两组,即Ad-GFP对照组和Ad-PSRC1实验组。3、巨噬细胞内脂质含量的检测油红O染色检测两组中经100μg/ml的ox-LDL处理的细胞的脂质含量,其定量数值由油红O阳性区域占总细胞面积的百分数(每一样本6张显微照片的平均数据)来表示。4、ELISA 检测 IL-6 和 TNF-α实验处理后,提取培养皿中细胞上清,1000g/min,4℃离心10min后取上清液,采用ELISA方法严格按照试剂盒说明书检测IL-6、TNF-α浓度。5、RT-qPCR方法检测mRNA的表达按照试剂盒说明,Trizol法提取RAW264.7的总RNA,分光光度计测定RNA含量和纯度,将RNA反转录为cDNA。用SYBR@qPCR Mix嵌合荧光法在LIGHT CYCLER 480上进行PCR扩增。选用β-actin作为内参基因,以上基因相对表达倍数均按2-△△Ct方法计算。6、Western Blot方法检测蛋白的表达处理细胞后,裂解液冰上裂解30min,细胞刮刮去细胞于EP管中,在4℃下,12000r/min离心15min,取上清;10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,转聚偏二氟乙烯膜。5%脱脂奶粉或BSA常温封闭1h,加一抗后,4℃孵育过夜。次日,TBST洗膜3次,加辣根过氧化物酶标记二抗,室温孵育1 h,再TBST洗膜3次,准备曝光。于暗室中应用ECL发光液及凝胶成像分析系统曝光显影,再运用Image J软件分析定量蛋白条带。7、统计学处理SPSS20.0统计软件进行统计分析。所有计量资料均以均数±标准差(Mean±SD)表示,两组间比较,统计方法采用Student’st-检验;三组间数据比较,如果方差齐性采用单向方差分析(one-way ANOVA),如果方差不齐采用Welch校正检验。多重比较时,如果方差齐性使用LSD法检验,方差不齐使用Dunnett’s T3检验,P<0.05视为差异具有统计学意义。研究结果1、重组腺病毒Ad-PSRC1和Ad-GFP转染RAW264.7巨噬细胞的最适MOI实验前先摸索腺病毒转染细胞的最适MOI,利用不同感染复数(multiplicities of infection,MOI)的 Ad-GFP(MOI=10,100,200,400)感染鼠源性 RAW264.7巨噬细胞48小时后,使用荧光倒置显微镜系统观察Ad-GFP的蛋白表达量(绿色荧光表示)。结果显示:腺病毒转染巨噬细胞过程,随着MOI值的升高,荧光强度逐渐增加,提示病毒的转染效率随之增加。2、病毒转染后PSRC1的mRNA和蛋白的表达量腺病毒转染细胞成功构建的实验验证过程,实验分别使用PBS、Ad-GFP和Ad-PSRC1转染RAW264.7巨噬细胞,PBS组作为Ad-GFP的空白对照组,48小时后,PBS组与Ad-GFP组PSRC1的mRNA和蛋白表达量均无统计学差异;相比 PBS 组和 Ad-GFP 对照组,Ad-PSRC1 组 RAW264.7 细胞 PSRC1 的 mRNA水平和蛋白水平的表达量均明显升高。3、PSRC1过表达对RAW264.7细胞内脂质含量的影响用10Oμg/ml的ox-LDL干预RAW264.7巨噬细胞48h后,经油红O染色实验结果显示:相比Ad-GFP组,Ad-PSRC1实验组细胞的阳性区域面积(即脂质含量)明显降低。4、PSRC1过表达对巨噬细胞中SR-A I和LDLR表达量的影响利用100μg/ml的ox-LDL干预RAW264.7巨噬细胞48h后,经RT-qPCR和WB实验检测,SR-A Ⅰ的mRNA水平和蛋白水平均明显降低;LDLR的mRNA水平和蛋白水平也均明显降低。5、PSRC1过表达对炎症因子IL-6、TNF-α的影响100μg/ml的ox-LDL干预病毒转染后的RAW264.7巨噬细胞48h后,收集细胞上清以及细胞悬液。相比Ad-GFP组,Ad-PSRC1组细胞中炎症因子IL-6和TNF-α的mRNA表达水平明显降低;另外,ELISA结果显示IL-6和TNF-α的分泌水平也明显降低。6、PSRC1过表达对β-catenin-NF-κB信号通路的影响相比Ad-GFP对照组,Ad-PSRC1组Raw264.7巨噬细胞的P-β-catenin和P-NF-κB的蛋白表达量明显降低,以及β-catenin的表达明显升高;Ad-PSRC1组巨噬细胞的胞核内β-catenin的蛋白表达量明显升高,而核内的NF-κB的蛋白表达明显降低。结论1、PSRC1过表达能够减少巨噬细胞中脂质的含量;2、PSRC1过表达能够降低ox-LDL摄取相关蛋白SR-A Ⅰ和天然LDL摄取相关蛋白LDLR的表达;3、PSRC1过表达能够降低IL-6和TNF-α的mRNA表达和蛋白分泌水平;4、PSRC1过表达能够上调β-catenin及下调NF-κB的蛋白表达。经实验研究我们发现:PSRC1过表达能够调节脂质代谢和减轻炎症反应,从而抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成。其机制可能是(1)通过降低ox-LDL摄取相关蛋白SR-A Ⅰ和天然LDL摄取相关蛋白LDLR的表达,改善巨噬细胞的脂质代谢;(2)通过下调炎症因子IL-6和TNF-α的表达,抑制巨噬细胞的炎症反应,其中β-catenin的上调和NF-κB的下调可能是参与炎症反应的重要信号通路。本研究为寻求AS及冠心病的诊疗新靶点提供了新思路。不足之处在于,实验仅局限于细胞层面,以及PSRC1对AS的直接影响和具体机制仍需进一步研究。