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三色堇(Viola×wittrockiana Gams.)是堇菜科(Violaceae)堇菜属(Vio/a)植物,花大而且花色丰富,在世界范围内都是重要的二年生观赏花卉,其色斑类型品种的色斑区域大,花斑遗传稳定,是研究花色花斑形成机理的理想材料。本课题组在三色堇RNA转录组分析中发现,酪氨酸脱羧酶基因(VwTYDC)在三色堇花瓣色斑和非色斑区域的表达量有着极显著差异,暗示VwTYDC基因有可能是导致三色堇花斑形成的一个潜在的候选基因,这使得VwTYDC基因成为植物花色分子机理研究的一个新的关注点。本研究以黄底紫斑的三色堇’梦蝶’品种为实验材料,扩增出VwTYDC基因全长并进行表达分析,以验证该基因的表达及其产物酪胺与色斑形成的相关性,为植物花色花斑的形成与调控提供新的研究视野与思路。具体结果如下:(1)实时荧光定量PCR检测发现VwTYDC基因在三色堇不同花期和不同器官中存在表达差异性,该基因在根中不表达,在花中的表达量显著高于茎和叶,不同花期中色斑区的表达量均高于非色斑区;(2)利用反转录聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术分离克隆出cDNA全长为1634 bp的VwTYDC1和1575 bp的VwTYDC 2两个同源基因,二者开放阅读框完全相同,编码494个相同氨基酸;(3)生物信息学分析表明:VwTYDC属于磷酸吡哆醛依赖的天冬氨酸氨基转移酶超家族(AAT_I superfamily),编码氨基酸与其他植物的一致性可达到82.43%,且与胡杨(Populus euphratica Oliv.)和麻疯树(Jatropha curcas L.)的亲缘关系最近;(4)利用高效液相色谱法(HPLC)对三色堇花瓣中的酪胺含量进行测定,发现色斑区域的酪胺含量均大于非色斑区域,且与VwTYDC基因的表达量成正比;(5)通过紫外分光光度法发现加入酪胺后的花色素峰值有了显著的红移和增长,表明酪胺可能作为辅助色素影响花色形成;(6)在植物组织培养基中外源添加酪胺及酪氨酸能够有效的诱导烟草花色素的生物合成和积累;(7)构建VwTYDC-pCAMBIA1301植物表达载体,并通过农杆菌介导转化烟草,成功筛选出抗性的转基因烟草植株。研究结果表明,三色堇VwTYDC基因通过在色斑区与非色斑区的差异表达,导致酪胺含量的差异,酪胺则可能通过促进花色素生物合成,以及作为辅助色素影响花色两方面的作用,促进色斑的形成。