在法医学实践中，心源性猝死是猝死的首要原因。在业已证实的冠心病猝死的病例中，由冠状动脉痉挛造成冠脉狭窄或闭塞，诱发心律失常导致死亡的病例占很大比例，这类原因导致的死亡案例，一般不伴有急性心肌梗死，冠状动脉无明显狭窄，尸检中无明显形态学改变，或生前有一些轻微的心电图异常；另外，部分冠心病猝死病例虽有冠状动脉狭窄，但由于心肌梗死发生后迅速死亡，也常无心肌梗死的形态学变化。对于上述由冠状动脉痉挛导致的心性猝死和急性心肌梗死造成的在短期(6小时)内死亡的冠心病猝死者，由于无典型的形态学变化，确切的死因判断较为困难，采用常规的病理学方法往往难于诊断，这是目前法医病理学所面临的一个难题，也是法医学的研究热点。 无论是冠状动脉痉挛或冠状动脉阻塞，都能够造成冠脉狭窄，引起急性心肌缺血或缺血后再灌注损伤，导致心肌梗死，因而急性心肌缺血和或缺血后再灌注损伤是冠心病心性猝死的根本原因，因此，能够寻找诊断早期心肌缺血再灌注损伤的较客观的指标，对于鉴定由冠状动脉痉挛导致的心性猝死和急性心肌梗死造成的短期内死亡的冠心病猝死者，具有非常重要的实际意义。 多年来，国内外学者一直在寻求能够用于诊断早期心肌缺血再灌注损伤的较客观的方法和技术，并取得一些有意义的成果，如心肌细胞的特殊染色，电子显微镜对心肌组织超微结构观察，应用酶组织化学染色技术、免疫组织化学染色、原位杂交技术和PCR技术等用于早期心肌梗死的诊断、以及从原癌基因及蛋白表达、细胞凋亡及调控蛋白检测、热休克蛋白及纤维连接蛋白的表达、雌激素、内皮素及其受体变化等方面，对急性心肌缺血损伤，心肌梗死早期诊断进行研究。 上述的这些研究从不同方面，在不同程度上丰富了急性心肌缺血和或缺血再灌注损伤早期诊断的内容，某些方面取得了初步的结果，虽然如此，但目前仍未发现一种灵敏、可靠和特异的病理学检测方法和指标可用于死亡尸体的急性心肌缺血再灌注损伤的早期诊断。目前对于疾病的研究已由细胞水平延伸至分子水平，因此对于心源性猝死的死后诊断分子生物学技术有着广泛的前景，可以设想在Genebank中寻找一些与心肌组织相关的基因，通过筛选找出在心肌组织缺血时异常表达的基因，探索其在心梗模型中的变化规律，期望用于实践。 抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization，SSH)技术建立于1996年，是以抑制PCR为基础的一种高效筛选差异表达基因的新方法，该方法能选择性地扩增目标cDNA片断并同时抑制非目标DNA的扩增，具有假阳性率低、敏感性高、保证低丰度基因被检出、快速、高效等优点，目前被广泛用于筛选疾病、发育、组织特异性或其他特异性表达基因。SSH不仅可成功筛选出与表型密切相关的基因，如实验方和驱动方为共源细胞株，而且也可用来自不同个体的同一或不同组织筛选它们与表型密切相关的差异表达基因。因此，为了明确急性心肌缺血再灌注对大鼠心脏基因表达的影响，本研究拟以抑制性消减杂交技术筛选心脏差异表达基因，并应用斑点杂交技术，逆转录PCR技术，筛选、克隆、鉴定并获得序列表达标签(Expressed sequence tag，EST)，通过对EST测序和基因同源性比较，明确急性心肌缺血再灌注大鼠的心脏基因表达谱，探讨急性心肌缺血再灌注损伤的分子机制，并为建立一种基于心脏差异表达基因的可用于早期心肌缺血诊断的敏感指标和方法提供基础。 料和方法： 60只纯种雄性清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠(中山大学中山医学院动物中心提供)体重180～230g、3～4个月龄；随机分为假手术组和心肌缺血再灌注组。 动物模型构建和鉴定：心肌缺血再灌注组手术结扎左冠状动脉前降支30分钟，再灌注120分钟。记录手术过程中心电图变化；取下腔静脉血液测量心肌酶谱；取缺血梗死区心肌组织常规HE染色；透射电镜观察缺血梗死区心肌组织超微结构改变。 筛选差异表达基因：提取缺血梗死区心肌组织Total RNA；反转录生成cDNA；分别以假手术组和心肌缺血再灌注组大鼠心肌cDNA作为Tester和Driver，进行顺向和逆向抑制消减杂交；转化SSH产物，构建cDNA文库；斑点杂交筛选差异表达基因；测序、利用Blast进行基因比对获得心肌缺血再灌注差异表达基因组谱，并进行one tube RT-PCR验证。 结果： 显示QRS波群增高适合作为冠状动脉完全结扎的心电图判断标准；大鼠心肌酶检测缺血再灌注组比假手术组心肌酶明显升高；常规病理切片：假手术组未见明显病理变化，再灌注120分钟组：梗死区部分毛细血管明显扩张，充血，部分心肌细胞肿胀，呈肌浆溶解状态。心肌超微结构病理变化：再灌注120分钟组：肌丝片状溶解、胞核肿胀、异染色质边集、肌原纤维形成异常收缩带；线粒体弥漫性肿胀，有的线粒体嵴断裂，溶解，缺失甚至空泡化；内质网扩张，空泡化；闰盘肿胀；微血管内皮细胞出现核固缩。假手术组则仅见线粒体轻微肿胀。 已知基因按照国际通用的分类标准(www．lgeneontologyl．org)将基因分为以下12类：能量代谢(energy metabolism，)，物质运输(Transport)，信号转导(Signal)，转录调控(Transcription regulator)，逆境反应(Response to stress)，发育(Development)，细胞组织与生物发生(Cell organization and biogenesis)，细胞运动(Cell Motility)，分化(Differentiation)，细胞周期(Cell cycle)，细胞粘连(Cell Adhesion)，细胞凋亡(Apoptosis)。不属于这12类的记为其他(others)。属于12大类基因有107个，见表4-3。属于12类基因中上调的为49个，下调基因58个；其他基因12个，上调5个，下调7个。 筛选出无同源基因的cDNA片段5个，其中上调2个，下调3个结论1、在构建大鼠心肌缺血再灌注模型中，对传统制模方式进行了改进，对大鼠心脏缺血再灌注去心肌组织超微结构进行了观察，并应用多种方法证明了动物模型的成功构建，。 2、首次应用SSH方法筛选大鼠心肌缺血再灌注相关的差异表达基因，并从方法学上对SSH及相关技术进行了改进，本研究方法适合于以组织为研究对象的差异表达基因的筛选。 3、在缺血再灌注大鼠心肌中获得68个下调EST，主要涉及到能量代谢相关基因、物质运输相关基因、信号转导相关基因；获得56个上调EST，涉及到逆境反应、细胞周期、发育、细胞粘连、转录调控、细胞凋亡等相关基因。 4、在缺血再灌注大鼠心肌中获得5个无同源基因的EST，其中上调EST2个，下调EST3个，这些新的EST，可能是为发现的基因，也可能是基因表达的中间产物。 5、成功构建了大鼠心肌缺血再灌注模型，成功构建了大鼠心肌缺血再灌注相关差异表达基因的cDNA文库，从分子水平上为研究心肌缺血再灌注损伤机制和筛选心肌缺血再灌注分子诊断指标奠定了基础。